[发明专利]一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物领域组织培养的诱导和培养方法，具体涉及绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法。

背景技术

棉花是世界性重要经济作物，彩色棉作为棉花品种的一类，是重要的纯天然、无污染绿色纺织产品的重要原料之一，随着人们生活水平的日益提高和纺织工业的飞速发展倍受青睐。彩色棉的纤维具有天然的棕、绿、黄、红等多种颜色，用它进行纺织可以不使用对环境有害的油剂、浆料、染料和其它后处理剂，避免了化工染料对人体的毒害作用和对棉纤维自身优良品质的破坏。但彩棉一直都受到产量低、纤维品质差、遗传不稳定等因素的限制，未能大面积示范推广。棉花转基因育种的突破极大地促进了世界棉花产业的发展，转基因育种作为传统育种的重要补充逐渐成为重要育种手段，拓展可再生彩棉品种基因型，尤其是具有重要推广价值的特色品种类型，胚性愈伤组织诱导是彩棉转基因研究的关键环节，也是彩棉转基因育种，进行彩棉品种改良和品质改善的重要途径和方法，具有重要的研究价值和发展前景。

在完成对棉花品质和抗性基因工程改造的同时，首先要建立一个高效的棉花再生体系。众所周知，棉花的再生工程受到基因型的限制很大，棉花的组织培养继代时间长，愈伤组织分化率低，重复性差。影响棉花体细胞再生的因素除外植体来源外，主要还有激素组合、培养基、氮源、碳源、无机盐、有机物等。目前仍旧没有任何一个体系可以完成对所有棉花品种的再生建立。目前所能做的就是扩展尽可能多得棉花品种来完成再生研究，在一定量的积累上实现质的突破。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，克服了绿棉体细胞胚胎发生及植株再生的困难，提供了一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，包括有以下步骤：

1)绿棉种子以硫酸脱绒后，再经过消毒洗涤，得到无菌绿棉种子，再将无菌绿棉种子在无菌环境下剥去种皮并接种于1/2MS固体培养基中，在光暗交替条件下进行培养，得到无菌苗下胚轴；

2)将步骤1)得到的无菌苗下胚轴在无菌条件下切为5-8mm小段，并置于绿棉愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养30天，得到初级培养绿棉愈伤组织；

3)将步骤2)得到的初级培养绿棉愈伤组织转接至绿棉愈伤组织增殖培养基并继代培养2次，得到增殖后绿棉愈伤组织；

4)将步骤3)得到的增殖后绿棉愈伤组织转入绿棉愈伤组织分化培养基，继代培养2次，得到胚性愈伤组织；

5)将步骤4)得到的胚性愈伤组织置于绿棉胚性愈伤组织增殖培养基上，进行扩繁培养。

上述的诱导和培养方法，所述步骤1)中，

硫酸脱绒所用的为95％的浓硫酸；

消毒洗涤的过程为：绿棉种子先以70％乙醇涮洗30s，再用30％过氧化氢浸泡3h，无菌水冲洗5-8遍，最后用无菌水浸泡8-12h至种子露白；

无菌绿棉种子的培养周期为4-8天，光暗交替过称为黑暗3-5天，关照1-3天。

上述的诱导和培养方法，所述步骤2)中，绿棉愈伤组织诱导培养基为按照以下比例加入了0.05-0.15mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和0.05-0.3mg/L的N6-异戊烯腺嘌呤，

或0.05-0.15mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.05-0.15mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和0.1-0.3mg/L吲哚乙酸的MSB培养基。

上述的诱导和培养方法，所述步骤3)中，绿棉愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了0.025-0.075mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.05-0.3mg/L N6-异戊烯腺嘌呤，

或0.05-0.3mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和0.1-0.3mg/L吲哚乙酸的MSB培养基。

上述的诱导和培养方法，所述步骤4)中，绿棉愈伤组织分化培养基为按照以下比例加入了1.9-3.8g/L KNO₃和1.8-2.5g/L凝固剂gelrite的MSB培养基。

上述的诱导和培养方法，所述步骤5)中，绿棉胚性愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了1.9-3.8g/L KNO₃、1.8-2.0g/L凝固剂gelrite、0.1-0.5g/L天冬酰胺和0.1-0.5g/L谷氨酰胺并且原始配方中NH₄NO₃的加入量减半的MSB培养基。

本发明的有益效果为：