[发明专利]基于无修饰抗体介导纳米金组装检测组蛋白修饰酶活性及筛选其抑制剂的生物传感方法

说明书

技术领域

发明属于一种检测组蛋白修饰酶活性及筛选其抑制剂的生物传感技术，其具体是指，组蛋白修饰酶底物的设计，组蛋白修饰酶底物肽与控制肽混合自组装比例，和基于无修饰抗体介导纳米金自组装的比色定量检测方法。

背景技术

组蛋白修饰酶及其抑制剂的检测与快速筛查对于生物学研究、医学研究、药物筛选等领域具有极其重要的意义。目前常用的组蛋白修饰酶活性的检测技术是基于酶催化反应中辅酶副产物的检测以及直接检测修饰产物，检测方法主要有比色法、荧光共振能量转移，荧光各向异性分析，免疫吸附分析以及质谱法等。这些检测技术灵敏度不高、可靠性差，且需要精密的仪器，不能满足准确快速检测的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出了一种基于修饰有组蛋白修饰酶底物肽的纳米金在组蛋白修饰酶的作用下，通过无标记抗体介导纳米金自组装，从而检测组蛋白修饰酶活性及筛选其抑制剂的生物传感方法，此方法设计简单，仅需设计一条组蛋白修饰酶识别的底物肽即可，在与待测的组蛋白修饰酶作用后，通过无标记抗体介导的纳米金组装即可实现检测，此方法操作简便、快速、灵敏。

本发明的技术方案是，所述基于无修饰抗体介导纳米金组装检测组蛋白修饰酶活性及筛选抑制剂的生物传感方法为：利用修饰有组蛋白修饰酶识别的底物肽的纳米金与组蛋白修饰酶相互作用，通过无修饰抗体介导纳米金组装后紫外吸收光谱的变化，定量分析检测组蛋白修饰酶的活性以及筛选其抑制剂。

以下对本发明作进一步说明

所述基于无修饰抗体介导纳米金组装检测组蛋白修饰酶活性及筛选其抑制剂的生物传感方法包括：

(1)组蛋白修饰酶底物肽的设计；

(2)组蛋白修饰酶底物肽与控制肽混合自组装的比例；

(3)采用基于无标记抗体介导修饰组蛋白修饰酶底物肽的纳米金组装的比色定量方法进行组蛋白修饰酶活性的定量检测以及相应抑制剂的筛选。

以下对本发明做出进一步说明。

组蛋白修饰酶底物的设计是由组蛋白修饰酶的识别底物肽加上由半胱氨酸组成的间隔肽组成。

组蛋白修饰酶底物肽与控制肽混合自组装的比例可由反应最大信噪比时对应的比例得到，组蛋白修饰酶底物肽与控制肽混合自组装比例选择在1∶9到9∶1之间。

所述用无标记抗体介导修饰有组蛋白修饰酶底物肽的纳米金组装的比色定量方法进行组蛋白修饰酶活性的定量检测以及相应抑制剂的筛选采用以下步骤实现：

对于组蛋白修饰酶活性的定量检测，检测步骤是：取所述组蛋白修饰酶底物肽与控制肽以前述比例混合自组装的纳米金置于微量管中；再于微量管中加入相应的组蛋白修饰酶与辅酶的混合溶液；然后加入所对应修饰位点的抗体反应，得不同颜色的反应产物；

对于组蛋白修饰酶抑制剂的检测，检测步骤是：取所述组蛋白修饰酶底物肽与控制肽以前述比例混合自组装的纳米金置于微量管中；再加入相应的组蛋白修饰酶与抑制剂的混合溶液，混合均匀后加入辅酶溶液；再加入所对应修饰位点的抗体反应，得不同颜色的反应产物。

进一步地，本发明中，所述无标记抗体介导修饰有组蛋白修饰酶底物肽的纳米金组装的比色定量方法进行组蛋白修饰酶活性的定量检测以及相应抑制剂的筛选采用以下步骤实现：

a.对于组蛋白修饰酶活性的定量检测，检测的步骤是：取30μL上述组蛋白修饰酶底物肽与控制肽以前述比例混合自组装的纳米金置于微量管中，加入20μL 3×组蛋白修饰酶反应缓冲溶液，然后加入9μL包含组蛋白修饰酶与辅酶的混合溶液，在组蛋白修饰酶最适的反应温度下反应1小时，再加入1μL一定浓度的所对应修饰位点的抗体室温震荡反应10分钟。

b.对于组蛋白修饰酶抑制剂的检测，检测的步骤是：取30μL上述组蛋白修饰酶底物肽与控制肽以前述比例混合自组装的纳米金置于微量管中，加入20μL 3×组蛋白修饰酶反应缓冲溶液，然后加入5μL包含组蛋白修饰酶与抑制剂的混合溶液(事先混合反应好)，混合均匀后加入一定浓度的辅酶溶液4μL，在组蛋白修饰酶最适的反应温度下反应1小时，再加入1μL一定浓度的所对应修饰位点的抗体室温震荡反应10分钟。

注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改变比例或试剂加入顺序可使被无标记抗体介导修饰组蛋白修饰酶底物肽的纳米金组装效率在1％～100％内变化。

本发明中，所述组蛋白修饰酶活性的定量检测以及相应抑制剂的筛选可采用比色方法，以下是用比色方法对组蛋白修饰酶活性的定量检测及相应抑制剂筛选的步骤：