[发明专利]肠杆菌科中沙门氏菌和志贺氏菌的快速筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肠杆菌科中沙门氏菌和志贺氏菌的快速筛选方法。

背景技术

肠杆菌科由一群生物学性状相似、兼性厌氧、氧化酶阴性的革兰阴性杆菌组成，其中有一些对人类有较强的致病作用，可引起包括肠道感染、败血症和尿路感染在内的许多感染性疾病。沙门氏菌属和志贺氏菌属是其中非常重要的致病菌，可引起腹泻和肠胃炎等。目前筛选沙门氏菌和志贺氏菌的实验方法较为复杂，并且需要用很多底物，对可疑菌落的筛选也不够彻底。而临床实验室以鉴定为目的的生化试验通常比较费时、成本也较高，因此急需一种从生长在选择性肠道培养基上的非致病性细菌中快速筛选出沙门氏菌和志贺氏菌的试验方法。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种肠杆菌科中沙门氏菌和志贺氏菌的快速筛选方法。本发明采用混合底物法对色氨酸脱氨酶、焦谷氨酰氨肽酶和C-8酯酶的活性同时进行检测，以从培养基上的非致病性细菌中快速筛选出沙门氏菌和志贺氏菌。

本发明的技术方案：肠杆菌科中沙门氏菌和志贺氏菌的快速筛选方法为：将标本划线于麦康凯琼脂平板上，于36℃-38℃孵育18-20小时，然后检查平板上生长的无色菌落；挑出一个无色菌落，将其一部分用于检测氧化酶活性；另一部分接种于浸有色氨酸、焦谷氨酰-4-甲氧基萘胺和4-甲基伞形酮碘苯腈辛酸酯的滤纸条上，并用一滴水或缓冲液湿润；湿润后的接种条放置于保湿器皿中于36℃-38℃孵育2-3小时，然后将滤纸条置于Wood灯下检测荧光，荧光阳性表示C-8酯酶活性的存在；在纸条上滴一滴含有重氮染料和氯化铁的溶液，颜色变红表示不是沙门氏菌和志贺氏菌；有荧光但不变色表示是沙门氏菌；即无荧光又不变色表示是志贺氏菌。

前述方法中，滤纸的合适浸液量为：在1平方英寸的滤纸上浸有0.2-0.3ml含有色氨酸、焦谷氨酰-4甲氧基萘胺和4-甲基伞形酮碘苯腈辛酸酯各40-180微克的20mM Tris缓冲液，pH为7.5。

前述方法所用的滤纸是Whatman 3号(Whatman Ltd.Maidstone England)。

前述方法所用的重氮染料是90-100μg/ml的深红色GBC盐，所用的氯化铁溶液浓度为12-13mg/ml。

本发明实验检测结果见下表：

注：*可能为阴性，但一般情况下多为阳性。

本发明采用混合底物法对三种酶(色氨酸脱氨酶、焦谷氨酰氨肽酶和C-8酯酶)的活性同时进行检测。

苯丙氨酸脱氨酶反应的合适底物是苯丙氨酸；色氨酸脱氨酶反应的合适底物是色氨酸；这两个反应的显色剂是氯化铁。

焦谷氨酰氨肽酶反应的合适底物包括焦谷氨酰-α/β萘胺(pyroglutamyl-alpha/beta naphthylamide)、焦谷氨酰-4-甲氧基萘胺和焦谷氨酰对硝基苯胺(pyroglutamyl paranitroanalide)。

C-8酯酶反应的合适底物包括荧光素碘苯腈辛酸酯、4-甲基伞形酮碘苯腈辛酸酯、邻/对硝基苯碘苯腈辛酸酯、吲哚氧基碘苯腈辛酸酯、萘碘苯腈辛酸酯和4-甲氧萘碘苯腈辛酸酯。

与现有技术相比：本发明采用混合底物法对三种酶的活性同时进行检测，实验方法简单，所用底物较少，成本较低，能快速从肠杆菌科的非致病性细菌中筛选出沙门氏菌和志贺氏菌。

具体实施方式

本发明的实施例1：将标本划线于麦康凯琼脂平板上，于37℃孵育18小时，然后检查平板上生长的无色菌落；挑出一个无色菌落，将其一部分用于检测氧化酶活性；另一部分接种于浸有色氨酸、焦谷氨酰-4-甲氧基萘胺和4-甲基伞形酮碘苯腈辛酸酯的滤纸条上，并用一滴水或缓冲液湿润。滤纸的合适浸液量为：在1平方英寸的滤纸上浸有0.2ml含有色氨酸、焦谷氨酰-4甲氧基萘胺和4-甲基伞形酮碘苯腈辛酸酯各100微克的20mM Tris缓冲液(pH 7.5)，所用的滤纸是Whatman 3号(Whatman Ltd.Maidstone England)。湿润后的接种条放置于保湿器皿中于37℃孵育2小时，然后将滤纸条置于Wood灯下检测荧光，荧光阳性表示C-8酯酶活性的存在；在纸条上滴一滴含有重氮染料(90μg/ml的深红色GBC盐)和12mg/ml氯化铁的溶液，颜色变红→非沙门氏菌和志贺氏菌；有荧光但不变色→沙门氏菌；即无荧光又不变色→志贺氏菌。

本发明的实施例2：将标本划线于麦康凯琼脂平板上，于36℃孵育20小时，然后检查平板上生长的无色菌落；挑出一个无色菌落，将其一部分用于检测氧化酶活性；另一部分接种于浸有色氨酸、焦谷氨酰-4-甲氧基萘胺和4-甲基伞形酮碘苯腈辛酸酯的滤纸条上，并用一滴水或缓冲液湿润。滤纸的合适浸液量为：在1平方英寸的滤纸上浸有0.3ml含有色氨酸、焦谷氨酰-4甲氧基萘胺和4-甲基伞形酮碘苯腈辛酸酯各160微克的20mM Tris缓冲液(pH 7.5)，所用的滤纸是Whatman 3号。湿润后的接种条放置于保湿器皿中于36℃孵育3小时，然后将滤纸条置于Wood灯下检测荧光，荧光阳性表示C-8酯酶活性的存在；在纸条上滴一滴含有重氮染料(100μg/ml的深红色GBC盐)和13mg/ml氯化铁的溶液，颜色变红→非沙门氏菌和志贺氏菌；有荧光但不变色→沙门氏菌；即无荧光又不变色→志贺氏菌。