[发明专利]微寡聚核苷酸PCR检测的方法、组成和应用

权利要求书

1.一种微寡聚核苷酸的PCR检测方法，所述的微寡聚核苷酸是长度小于25bp的DNA，所述方法包括：

(1)提供一延伸引物，且其一个末端的核苷酸序列与所述的微寡聚核苷酸互补；所述的延伸引物的长度在20-100bp；将所述的延伸引物与所述微寡聚核苷酸在适于DNA延伸的条件下混合，从而两者互补结合并延伸，获得包含有所述微寡聚核苷酸的序列以及引物互补序列的寡聚核苷酸；

(2)以(1)获得的寡聚核苷酸为模板，进行PCR扩增，获得该模板的PCR定性或定量结果，从而获得所述微寡聚核苷酸的PCR定性或定量结果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的延伸引物的序列结构如式(I)：

M-P    (I)；

其中，M为与所述的微寡聚核苷酸互补的核苷酸序列；

P的序列结构如式(II)：

Seq-H-Seq’    (II)；

其中，Seq是4-20个核苷酸，Seq’为与Seq互补的序列；

H为Seq和Seq’之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq和Seq’不互补。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，M的长度是4-20bp。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用Taq酶或Klenow酶作为DNA延伸用的酶。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增的正向引物和反向引物根据所述的寡聚核苷酸两端的序列制备。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用实时荧光PCR法进行PCR定量。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)在一个PCR体系中进行；所述的PCR体系通过温度转换达到适于DNA延伸的条件或适于DNA扩增的条件。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在DNA延伸步骤之后，将PCR体系在2-15℃冷处理2-10min。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)在一个PCR体系中进行，包括步骤：95℃2min，40℃30S，72℃60S，2-10℃2-10min，95℃1min；然后以下步骤进行30-45个循环：95℃10S，50℃30S，72℃10S。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的PCR体系包括：微寡聚核苷酸，延伸引物，DNA延伸用的酶，PCR扩增引物；较佳地，所述的PCR体系还包括荧光探针；或

所述的PCR体系是Realtime PCR Master Mix体系，且其中还包括：微寡聚核苷酸，延伸引物，DNA延伸用的酶；较佳地，所述的PCR体系还包括荧光探针。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微寡聚核苷酸的一端还与结合分子连接。

12.一种用于微寡聚核苷酸的PCR定量检测的试剂盒，其中包括：

延伸引物，其一个末端的核苷酸序列与所述的微寡聚核苷酸互补；所述的延伸引物的长度在15-100bp；

DNA延伸用酶；

PCR扩增试剂。

13.一种用于检测病源细胞的试剂盒，其中包括：

(i)检测病源细胞的靶向性分子，结构如下：

X-Y；

其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子；Y代表微寡聚核苷酸；

“-”代表X和Y之间的共价连接、偶联或偶合的关系；

(ii)延伸引物，且其一个末端的核苷酸序列与(i)中Y的远离X的末端互补；所述的延伸引物的长度在15-100bp；

(iii)DNA延伸用酶；

(iv)PCR扩增试剂。