[发明专利]微寡聚核苷酸PCR检测的方法、组成和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及微寡聚核苷酸PCR检测的方法、组成和应用。

背景技术

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两个拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入热稳定性DNA聚合酶和dNTP就可以完成特定序列的体外复制。聚合酶链式反应(PCR)就是这样的一种在体外由热稳定性DNA聚合酶促合成特异DNA片段的方法。该方法由高温变性、低温退火及适温延伸等三步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。PCR具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于基于任何DNA、RNA检测的疾病诊断。

在本发明人之前的工作中，通过靶向PCR和免疫PCR将DNA与抗体或小分子化合物偶联在一起，扩展了PCR的检测范围，使PCR可检测任何可被抗体或小分子化合物识别的抗原或携带抗原的细胞。但是本发明人在实验中发现：将DNA与抗体或小分子化合物偶联在一起，会降低抗体或小分子化合物与抗原或受体结合的亲和力。偶联的DNA分子越大，序列越长，相应的亲和力会显著降低，现有数据表明DNA序列长20个碱基，小分子化合物与DNA的偶合物对抗原的亲和力会降低5-10倍。这大大限制了靶向PCR或免疫PCR的应用。因此缩短偶联的DNA序列，降低DNA分子量成为提高靶向PCR检测灵敏度的首选方案。但是，缩短的DNA序列导致PCR检测的难度大大提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微寡聚核苷酸PCR检测的方法、组成和应用。

在本发明的第一方面，提供一种微寡聚核苷酸的PCR检测方法，所述的微寡聚核苷酸是长度小于25bp(较佳地小于22bp；更佳地小于18bp，如16bp)的DNA，所述方法包括：

(1)提供一延伸引物(RT引物)，且其一个末端(如5’端)的核苷酸序列与所述的微寡聚核苷酸(如3’端)互补；所述的延伸引物的长度在20-100bp(较佳地25-100bp；更佳地30-100bp，如40bp、50bp、60bp、70bp、80bp)；将所述的延伸引物与所述微寡聚核苷酸在适于DNA延伸的条件下混合，从而两者互补结合并延伸，获得包含有所述微寡聚核苷酸的序列以及引物互补序列的寡聚核苷酸；

(2)以(1)获得的寡聚核苷酸为模板，进行PCR扩增，获得该模板的PCR定性或定量结果，从而获得所述微寡聚核苷酸的PCR定性或定量结果。

在一个优选例中，步骤(1)中，所述的延伸引物的序列结构如式(I)：

M-P    (I)；

其中，M为与所述的微寡聚核苷酸互补的核苷酸序列；

P的序列结构如式(II)：

Seq-H-Seq’    (II)；

其中，Seq是4-20个(如18个、15个、12个、10个、8个、6个)核苷酸，Seq’为与Seq互补的序列；

H为Seq和Seq’之间的间隔序列(通常7-40个碱基；如35个、30个、25个、20个、15个、12个、10个、9个、8个)，所述间隔序列与Seq和Seq’不互补。

在另一优选例中，式(I)结构为：5’M-P  3’。

在另一优选例中，“-”代表H和Seq、Seq’之间的共价连接关系。

在另一优选例中，式(II)可以形成如下二级结构：

其中，||表示在Seq和Seq’之间形成的氢键。

在另一优选例中，式(II)为：5’Seq-H-Seq’3’。

在另一优选例中，M的长度是4-20bp。

在另一优选例中，M的长度是6-16bp；更佳地，M的长度是6-14bp；最佳地，M的长度是8-10bp。

在另一优选例中，步骤(1)中，采用Taq酶或Klenow酶作为DNA延伸用的酶。

在另一优选例中，采用Taq酶作为DNA延伸用的酶，且步骤(1)中，延伸包括如下步骤：95℃变性，2min；60℃退火30s；72℃延伸5min。