[发明专利]非对称发夹探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物反应技术，特别是涉及一种非对称发夹探针链反应技术。 

背景技术

核酸分子固相杂交法、DNA测序法、毛细管电泳分析、基因芯片技术等检测方法的先后建立，将细菌分子检测方法提高到一个崭新的阶段，但是这些检测方法大多需要特殊的大型仪器，技术难度大，难以在临床中普及应用。此外，大多需要预先对样本进行PCR扩增，严重干扰了致病菌的定量检测，同时PCR技术存在的实验室污染问题也极大地影响了这些检测方法的准确性。 

DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。DNA探针是利用同位素、生物素等标记的特定DNA片断，该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。当DNA探针与待测的非标记单链DNA(或RNA)按碱基顺序互补结合时，以氢键将2条单链连接而形成标记DNA-DNA(或标记DNA-RNA)的双链杂交分子。将未配对结合的探针洗去稀后用检测系统(放射自显影或酶检测等)检测杂交反应结果。由于DNA分子碱基互补的精确性，单连DNA探针仅与样品中变性处理的DNA单链出现配对杂交，由此决定了探针的特异性；用放射性同位素(如32P)或生物素标记探针，使杂交试验同时具有高度的敏感性。 

Applied Gene Technologies公司的专利名称为“发夹形核酸探针技术”(Nucleic Acid Hairpin Probes)，专利号为6380377涉及到一种茎环形DNA探针技术，与标准的单链核酸探针相比结构更稳定，酶反应更高效，对错配更加敏感，产生了更少的非特异性靶位结合。这些优点都提高了基因分析的 特异性。 

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明设计了非对称发夹探针，并发明了一种非对称发夹探针链反应技术，巧妙地结合了分子杂交的高特异性和链式聚合的高效性，通过DNA聚合释放的自由能驱动分子级联放大，其反应体系简单，检测效率高，且有效地避免了PCR等传统技术存在的实验室污染问题。 

非对称发夹探针1，其特征在于：包括回文序列、两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘性末端，所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列为无关序列，所述茎臂与其连接的粘性末端具有靶序列的互补核酸序列。 

所述粘性末端位于非对称发夹探针1的5’端。 

非对称发夹探针2，其特征在于：包括回文序列、两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘性末端，所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列与其相连的一条茎臂具有靶序列，所述另一茎臂上相连的粘性末端具有和上述无关序列的互补核酸序列。 

所述粘性末端位于非对称发夹探针2的3’端。 

所述粘性末端为6-8个碱基。 

非对称发夹探针在快速检测待测靶序列中的应用。 

所述应用为液相杂交链反应体系，所述反应体系中同时加入有非对称发夹探针1和非对称发夹探针2以及待测靶序列，其中所述非对称发夹探针1的粘性末端位于非对称发夹探针1的5’端，所述非对称发夹探针2的粘性末端位于非对称发夹探针1的3’端；或者所述非对称发夹探针1的粘性末端位于非对称发夹探针1的3’端，所述非对称发夹探针2的粘性末端位于非对称发夹探针1的5’端。 

所述待测靶序列为细菌的16S rDNA序列。 

所述细菌为金黄色葡萄球菌，所述非对称发夹探针1、非对称发夹探针2和待测靶序列分别为： 

SA-H1：TTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGCAAAGTCCGTCCGCCGCTAACATC， 

SA-H2：CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAAGATGTTAGCGGCGGACGGACTTTG， 

Tsa：CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAA。 

所述细菌为铜绿假单胞菌，所述非对称发夹探针1、非对称发夹探针2和待测靶序列分别为： 

PA-H1：CGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC， 

PA-H2：ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGT， 

Tpa：ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。 

所述细菌为肺炎克雷伯菌，所述非对称发夹探针1、非对称发夹探针2和待测靶序列分别为： 

KP-H1：