[发明专利]哈维氏弧菌的荧光定量PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的荧光定量PCR快速检测方法。

背景技术

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是革兰氏阴性菌，菌体杆状，极生单鞭毛运动，TCBS(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium)平板上生长，菌落呈黄色或绿色，嗜盐菌。哈维氏弧菌广泛存在于海洋环境中，是条件致病菌。在适宜的条件下，它们大量繁殖成为优势菌，通过消化道或者伤口感染，致使伤口肌肉溃烂化脓以及内脏器官的严重病变而导致海水动物发病死亡，是水产养殖动物鱼、虾的重要致病菌。

现有哈维氏弧菌的检测方法主要有常规分离鉴定法、普通PCR检测法、胶体金免疫层析试验法等。荧光定量PCR技术通过TaqMan探针与模板的特异性杂交来鉴别模板，具有很高的准确性，假阳性低，特异性好。目前尚未见用荧光定量PCR方法快速检测哈维氏弧菌的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测速度快、灵敏度高的快速检测哈维氏弧菌的荧光定量PCR方法。

研究表明：哈维氏弧菌携带的toxR基因是其毒力基因的表达调控基因。本发明根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)网站上公布的哈维氏弧菌toxR基因全序列，以该特异基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，并且采用荧光定量PCR快速技术检测哈维氏弧菌，具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。可以作为水产品中哈维氏弧菌的快速、简便、准确的检测方法。

本发明的技术解决方案是：一种快速检测哈维氏弧菌的方法，其特征在于有如下步骤：

(1)首先提取待检样品TCBS平板上可疑菌落的基因组DNA。

(2)荧光定量PCR反应液(25μL体系)：

其中包括提取的基因组DNA，1μL；10×PCR buffer，2.5μL；Mg²⁺，2mmol/L；Taq酶2U；UNG酶1U；dNTP 0.2mmol/L；哈维氏弧菌特异性引物200nmol；TaqMan探针200nmol，最后加灭菌去离子水至25μL。

(3)荧光定量PCR仪程序参数：94℃预变性10min；94℃变性15s，60℃退火1min，同时收集FAM荧光，40个循环，40℃1min，4℃保存。

其中哈维氏弧菌特异性引物为：

上游引物Vharveyi-1：5′-GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3′，

下游引物Vharveyi-2：5′-GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3′

特异性TaqMan探针为：

Vharveyi-3：5′-TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3′

荧光定量PCR反应结束后，哈维氏弧菌能形成典型的S型扩增曲线，而且Ct值＜35。

本发明提供了扩增哈维氏弧菌的特异性引物Vharveyi-1、Vharveyi-2和TaqMan探针Vharveyi-3，从而提供了一种快速检测哈维氏弧菌的方法，同现有检测技术相比具有如下优势：

快速性：没有后处理，不用电泳、拍照，实时缩短了反应时间。

灵敏度高：光谱技术和计算机技术的联合使用，极大提高了检测的灵敏度。

特异性强：荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，二者缺一不可，故不存在非特异性扩增现象。

有效解决PCR污染：整个过程均在单管中进行，且勿需打开管盖，避免了PCR产物对实验室的污染。

具体实施方式

首先无菌操作取25g待测水产品，充分剪碎，放入盛有225mL灭菌海水的灭菌容器中，进行10倍梯度稀释后，选择2～3个适当稀释度，各以0.1mL涂布到TCBS平板上，在36℃±1℃培养箱中，倒置培养24h±3h。挑取5个可疑菌落提取基因组DNA并稀释备用。如果平板上的可疑菌落少于5个，则应该全部挑取进行基因组DNA提取并稀释备用。