[发明专利]一种新型白果蛋白的制备和表征方法

权利要求书

1.一种新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于新鲜白果经脱脂和减压沸腾提取，分离富集蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带。

2.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于蛋白belt1由分子量分别为m/z 1408.65、1663.94、1823.86、2064.99和2208.08五条肽段组成的球蛋白11S-globulin，通过NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到蛋白质gi/949869(legumin)，分子量为51418，等电点(pI)8.69。

3.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于蛋白belt2为新蛋白，由分子量m/z：2131和m/z：2338肽段组成，m/z：2131肽段的精确序列为I/L S A I/L T A DI/LG N W Q/K D S P GI/L R，m/z：2338肽段的精确序列为A A Q/K V D S S S D V Y A S D NI/L P G G N R。

4.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于蛋白belt3为分子量分别为1605、1913、2053、2242和2355五5个肽段组成，通过NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到的蛋白是belt1蛋白和belt2蛋白混合物。

5.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于新型白果蛋白富含16种氨基酸，其中丙氨酸(Ala)、赖氨酸(Lys)和缬氨酸(Val)大于4.0％，天冬氨酸(Asp)大于6.5％，丝氨酸(Ser)大于10.5％，组氨酸(His)大于40.5％。

6.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于新鲜白果在-10℃至-50℃下冷冻干燥，除去外壳和内衣，将果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6％、粒度在10目-50目的白果粗粉。再用非极性溶剂与白果粗粉按质量比例4-30∶1(g/g)加入到脱脂釜萃取0.5～10小时，萃取温度-10℃至80℃，过滤，滤渣在室温通风下干燥，制备脱脂白果粉。

7.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于减压沸腾提取是将脱脂白果粉加入到0.1-0.50mol/L NaCl盐溶液减压沸腾提取5～30min，提取溶剂pH8-9，提取温度20℃-75℃，脱脂白果粉与提取剂质量体积比例为1∶3-1∶30(g/ml)，提取次数2-6次，合并提取液。

8.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于分离纯化是将盐溶液提取液经过40％-80％硫酸铵溶液两次沉淀，沉淀时间3-24h，pH 5-7，滤液经过不同孔径膜切割分离分子量10 000Da～30 000Da的蛋白质溶液，-10℃至-50℃下冷冻干燥制备高纯度白果蛋白粉。

9.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于分离纯化是采用DEAE-Cellulose树脂对白果蛋白粉进行纯化。白果蛋白粉与去离子水质量体积比例为1∶3-1∶50(g/ml)，用缓冲液pH 7.0-9.5的0.1-1.5mol/L NaCl溶液洗脱树脂，洗脱下来的蛋白质样品经过电泳分析，得到蛋白质样品由分子量为21.4KDa、17.9KDa和15.8KDa谱带组成。

10.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于分离纯化是将DEAE-Cellulose树脂洗脱液经过葡聚糖凝胶G纯化，分离得到蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带。

11.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备方法，其特征在于新型白果蛋白采用电泳技术及MALDI-TOF-TOF质谱技术对纯化的蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带进行一级结构表征。

12.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备方法，其特征在于新型白果蛋白富含16种氨基酸，其中丙氨酸Ala、赖氨酸(Lys)和缬氨酸Val大于4.0％，天冬氨酸Asp大于6.5％，丝氨酸(Ser)大于10.5％，组氨酸(His)大于40.5％。

13.根据权利要求5所述非极性溶剂，其物征为正己烷、石油醚、6号溶剂油、丙酮等溶剂中一种或几种任意比例的混合溶剂。