[发明专利]一种促进绵羊卵母细胞体外发育的方法

权利要求书

1.一种促进绵羊卵母细胞体外发育的方法，其特征在于：采用腺苷酸环化酶激活剂，即为FSK，磷酸二酯酶抑制剂，即为CIL，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，即为IBMX，联合对绵羊卵母细胞进行处理，提高其体外发育能力，其步骤为：

其1 摘取宰杀30分钟内的绵羊卵巢，置入温度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用其生理盐水清洗3-4次；吸有1ml加有100 μMol/L的FSK和500μMol/L IBMX的抽卵液，带有9号针头的10ml注射器，抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液打在35-60mm的皿内；

其2 在显微镜下捡出卵母细胞，放置在抽卵液中2小时，用含有20μMol/L CIL的体外成熟液洗涤3次，置于CO₂箱，在5% CO₂、95%空气、温度为38.6℃条件下培养2小时；再用不含CIL的体外成熟液洗涤3次，置于CO₂箱培养22-24小时；用体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入2小时前平衡好的50-70μl的体外受精液滴内;

其3 用水浴解冻精液，移入2小时前平衡好的装有体外受精液的试管内，放入CO₂箱，上游20-25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速，离心4-5分钟弃去上清液，按2-4×10⁶个/ml的密度加入体外受精液滴，与卵母细胞共同孵育；

其4 将受精22-24小时的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，洗涤3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的体外培养液的四孔培养板内培养， 24小时后统计卵裂率，168小时后统计囊胚率；将囊胚放在Hochest33342中平衡10分钟，载玻片上压片，在紫外光激发器作用下统计囊胚细胞数；

其中实验液体的配制：

抽卵液：TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7 mg／ml肝素钠+100 μMol/L FSK+500μMol/L IBMX；

   含CIL的体外成熟液：TCM199-HCO₃十10%FBS十0.05IU/ml FSH十0.05IU/ml LH十1μg/ml雌二醇＋24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L 半胱氨酸+10ng/ml EGF+20μMol/L CIL +100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素；

  不含CIL的体外成熟液：TCM199-HCO₃十10%FBS十0.05IU/ml FSH十0.05IU/ml LH十1μg/ml雌二醇＋24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L 半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素；

SOF：6.29mg/ml NaCL +0.534 mg/ml KCL+0.162 mg/ml KH₂PO₄+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO₄+2.1mg/mlNaHCO₃+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL₂·2H₂O；

体外受精液：SOF+20%FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；

体外培养液：SOF+3mg/mlBSA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所用腺苷酸环化酶激活剂，磷酸二酯酶抑制剂，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，Hochest33342为SIGMA公司生产。