[发明专利]一种促进绵羊卵母细胞体外发育的方法

说明书

技术领域

本发明涉及促进绵羊卵母细胞的体外发育，采用腺苷酸环化酶激活剂Forskolin（FSK）、磷酸二酯酶抑制剂cilostamide（CIL）和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤3-isobutyl-1-methylxanthine（IBMX），联合对绵羊卵母细胞进行处理，能显著提高其体外发育能力。

背景技术

在畜牧业上利用体外受精技术能以工厂化的形式批量生产试管胚胎，从而为家畜胚胎移植提供更多的高质量的胚胎，促进家畜良种化。体外受精技术主要包含卵母细胞体外成熟、精子获能受精、胚胎体外培养三个环节。

对于哺乳动物卵母细胞而言，高浓度的环磷酸腺苷（cAMP）能使减数分裂受到抑制，从而抑制卵母细胞的核成熟，为细胞核和细胞质同步成熟创造时间，进而能提高卵母细胞成熟质量。FSK能刺激腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase)的活性，从而升高细胞内的cAMP水平。IBMX和CIL都属于磷酸二酯酶抑制剂,它们通过减少cAMP的降解来提高cAMP浓度。

文献检索披露：1. Biology of reproduction，65(2001), 1444–1451，作者：FJ Richard等发表的《3A型磷酸二酯酶在鼠卵母细胞成熟中的作用》，通过对不同阶段卵母细胞检测，研究了3A型磷酸二酯酶在鼠卵母细胞中的性质和表达规律。2. Molecular Reproduction and Development，70，3（2005）,  361-372, 作者：MF Laforest等发表的《特异性磷酸二酯酶对猪卵母细胞自发减数分裂恢复控制的重要意义》研究中得出，CIL和IBMX能可逆性地阻滞减数分裂的恢复。3.Human Reproduction,23,3（2008），504-513，作者：Yi-min Shu等发表的《cilostamide和forskolin对人未成熟卵母细胞减数分裂的恢复和胚胎发育的影响》中指出，联合使用CIL和FSK能通过阻止缝隙连接通讯丢失和恢复减数分裂的协同效应，影响人卵母细胞的发育能力。4.Human Reproduction, 25, 12 （2010），2999-3011, 作者：F.K. Albuz等发表的《卵母细胞成熟的生理模型：一种能显著提高胚胎生产和妊娠结果的新的体外成熟系统》文章,得出，成熟前的牛、鼠卵母细胞使用SPOM系统，能增加卵母细胞-卵丘细胞复合体间的缝隙连接，减缓减数分裂进程，能显著提高牛卵母细胞体外受精囊胚率和囊胚质量，显著提高小鼠囊胚率、移植受胎率和胎儿出生率。国内有1999年7卷3期《农业生物技术》上陈勇等人发表的《Forskolin对昆明白小鼠卵母细胞体外成熟及卵丘扩展的影响》、2007年12卷5期《中国农业大学学报》上卜淑敏等人发表的《3种磷酸二醋酶对小鼠卵母细胞自发成熟的影响》等等。上述已有方法用于牛和鼠、猪，但很少有用于提高绵羊卵母细胞发育能力的报道。本发明以此为切入点，展开的研究方法具有科学性与实践性。

发明内容

本发明的目的在于：使用三种试剂促进绵羊卵母细胞体外发育的方法，能显著提高体外受精效率，将该方法用于良种繁育，将缩短育种时代间隔，显著降低生产成本。

本发明的目的是这样实现的：一种促进绵羊卵母细胞体外发育的方法，采用腺苷酸环化酶激活剂，即为FSK，磷酸二酯酶抑制剂，即为CIL，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，即为IBMX，联合对绵羊卵母细胞进行处理，提高其体外发育能力，其步骤为：

其1 摘取宰杀30分钟内的绵羊卵巢，置入温度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用其生理盐水清洗3-4次；吸有1ml加有100 μMol/L的FSK和500μMol/L IBMX的抽卵液，带有9号针头的10ml注射器，抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液打在35-60mm的皿内；

其2 在显微镜下捡出卵母细胞，放置在抽卵液中2小时，用含有20μMol/L CIL的体外成熟液洗涤3次，置于CO₂箱，在5% CO₂、95%空气、温度为38.6℃条件下培养2小时；再用不含CIL的体外成熟液洗涤3次，置于CO₂箱培养22-24小时；用体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入2小时前平衡好的50-70μl的体外受精液滴内;