[发明专利]卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域的液相芯片检测试剂盒，尤其是一种卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

卵巢癌是目前国内外常见的妇科恶性肿瘤，其死亡率已排全部妇女恶性肿瘤的第四位，在女性生殖道恶性肿瘤中居首位，并有上升趋势。卵巢癌发病隐匿，早期缺乏典型的临床症状。由于卵巢特殊的解剖学位置，常规体格检查和盆腔双合诊很难在早期发现卵巢癌。到目前为止，在病变I期被确诊病人仅有25％，而且当病变发展到晚期(III、IV)时，即使得到恰当的治疗其5年存活率也由I期的95％下降到20-25％。因此，加强卵巢癌的二级预防，及早发现、诊断、治疗是提高卵巢癌治疗效果的关键。故筛选和鉴定有高度敏感性及特异性、能用于早期卵巢癌诊断的血清标志，对于改善临床预后和提高存活率有重要意义。

CA₁₂₅是目前临床上应用最广泛的卵巢癌血清标志物，它在50％的I期、90％的晚期(III期、IV期)卵巢癌中升高，同时在妇科的良性病变、非妇科恶性肿瘤病人中也可升高。即便如此，CA₁₂₅与超声联合检测时对卵巢癌的阳性预测值也只有20％左右。正是因为其特异性及阳性预测值较低，限制了它在卵巢癌早期诊断中的应用。为此，有研究者将CA₁₂₅与其它血清标志物联合应用，以提高对卵巢癌的诊断效能。

越来越多的研究证实，在肿瘤形成过程中，肿瘤可刺激机体产生针对肿瘤相关抗原的免疫反应，其中最明显的特征就是抗体的产生，这种由广泛表达于肿瘤细胞的异常蛋白诱导产生的自身抗体，一般称之为肿瘤自身抗体。研究发现，检测抗原自身抗体的敏感度与特异度均高于传统检测抗原的方法，且自身抗体在许多恶性肿瘤患者术前的血清中升高，术后明显下降；而炎症反应等良性病变引起的短暂性抗原升高并不能刺激机体产生自身抗体；另外，检测抗原自身抗体还可以很好地避免假阳性。可见，血清中肿瘤自身抗体可能是肿瘤发生的报告分子，检测肿瘤自身抗体用于恶性肿瘤的诊断是一个很有前景的方法，并可用于病情预测。

然而，肿瘤患者由肿瘤抗原诱导产生的自身抗体阳性率过低，平均为15％～20％，很少超过50％，这限制了单个自身抗体作为肿瘤发生报告分子的可能性。分析单个肿瘤相关抗原自身抗体在诊断卵巢恶性肿瘤时均不理想，这说明卵巢恶性肿瘤的发生是一个多阶段、多步骤、多基因参与的过程，每个阶段都有其特异性开放表达的抗原，因此，通过寻找卵巢恶性肿瘤各个阶段的肿瘤相关抗原的自身抗体，组成自身抗体谱就可能为卵巢恶性肿瘤的分期、诊断及筛查等提供更全面的血清学标志物，联合多个标志物则可弥补其不足。

SEREX方法由Sahin等创立，即用肿瘤患者自体血清中的高滴度IgG抗体筛选肿瘤cDNA文库，获得肿瘤抗原的方法。运用该方法筛选得到的大量肿瘤抗原构成了一个刺激机体对肿瘤产生体液免疫应答的抗原库，而肿瘤患者体内针对这些抗原的相应自身抗体，则构成了一个既可用于筛选肿瘤特异性或相关性抗原，又可作为肿瘤诊断标志物的抗体谱。用SEREX方法可在多种肿瘤患者血液中检测到与肿瘤细胞胞内成分反应的自身抗体，获得了大量的由胞内抗原诱导产生的自身抗体，这也是以往方法所无法做到的。SSH(Suppression Subtractive Hybridization，抑制性消减杂交技术)是抑制性PCR与消减杂交技术相结合的更简单、更快速分离差异表达基因的方法，它不仅提高了特异性，降低了假阳性率，而且灵敏性高，保证了低丰度片段的检测成功。

免疫学检测最常用的技术有免疫斑点、免疫印迹、ELISA等，其中，ELISA方法最受重视，它简单、快速、敏感且易于自动化，适于大规模筛选样本。然而，ELISA每次一般只能对一种抗原/抗体进行分析，如果要对多种抗原抗体同时进行分析，其工作量就要大幅度增加，操控难度也相应增加。