[发明专利]一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及RNA干涉技术和功能基因组学，具体地说，涉及一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体。

背景技术

自从在秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中发现基于RNA干涉(RNAi)的基因敲除(knock out)或敲减(knock down)以来，RNA干涉技术已广泛应用于生命科学的各个领域，对揭示新的生命现象和发明新的技术方法都具有革命性意义。RNAi已用于微生物、线虫、果蝇、哺乳动物和植物特定基因功能的分析。在高通量基因克隆和功能验证方面，RNAi最早应用体外合成的dsRNA来大规模敲出或敲减C.elegans基因以便从基因组水平来剖析基因的功能。虽然在果蝇和哺乳动物培养细胞中有时存在脱靶(off target)现象，但是RNAi技术在这些生物中也取得了巨大的成功。在植物中，利用内含子两端的特定基因反向重复序列产生发卡双链小RNA(short hairpin RNA，shRNA)可以通过诱导植物内源基因高效沉默来研究特定基因的功能。一些基于发卡小干涉RNA(hairpin small interfering RNA，hsiRNA)的高效载体如pHANNIBAL/KANNIBAL，pHellsgate等已用于敲减一个或几个特定基因的表达。但是，由于克隆过程的复杂，这些载体在全基因组RNAi的功能基因组学研究中的应用受到限制。为了获得可用于基因组水平RNAi的载体，Brummell等(2003)构建了只需一步克隆操作的SHUTR载体，通过在一个基因的末端连接一个3’-UTR(NOS终止子)的反向重复序列，在植物中产生双链发卡结构RNA来沉默靶基因。这个载体在番茄和拟南芥中的有效性分别用PG基因、T10P11.13和Athb-1基因进行了验证，沉默效率约为90％，并且用于表达叶肉细胞cDNA文库，获得相关突变体。与传统T-DNA和转座子插入不同，RNAi技术有很多优势：1.RNAi引起的功能缺失(loss-of-function)突变体筛选是基于序列的同源性，因而较随机插入方法需要小得多的突变群体而且目的基因鉴定很容易。2.RNAi基因表达敲减产生的突变是显性的，在第一代转基因群体便可以进行表型筛选，节省大量突变体筛选所用时间和劳力。3.RNAi可以敲减多个相近基因的表达进而克服基因的冗余性。4.由于RNAi是一种可以时空特异调控的基因表达敲减体系，因此可以克服必需基因敲除引起的致死性。由此可见，RNAi在植物功能基因组，特别是具有复杂基因组的作物功能基因组研究中，突变筛选和基因克隆最具潜力的工具。高通量RNAi技术在玉米中已得到初步验证，在766个独立转基因系中沉默了99个基因，RNAi转基因结构可以在玉米中稳定遗传，并且可以沉默目的基因及其相近基因，证明了RNAi技术在作物功能基因组中的可行性。无论发卡结构的双链小RNA(shRNA)，还是较长的双链RNA(dsRNA＞200bp)都可以高效沉默植物内源基因的表达。体外合成的或细菌中用共轭启动子产生的dsRNA已成功应用于C.elegans和果蝇的功能基因组研究来鉴定基因功能。虽然基于长双链RNA(ldsRNA)的反义抑制技术已广泛应用于植物基因功能研究，但是ldsRNA基因沉默在植物功能基因组研究中还没有报道。与C.elegans类似，外源ldsRNA浸泡和饲喂也可以沉默寄生线虫体内同源基因的表达。寄主输出性的RNA干涉技术(Host-Delivered RNAi，HD RNAi)利用寄主植物表达害虫的长双链RNA(ldsRNA)，通过进食进入害虫体内引起害虫重要功能基因的沉默，达到杀死或减弱害虫生活力的目的。HD RNAi正成为获得害虫抗性植物极具潜力的新技术，已成功用于获得对昆虫和线虫具有抗性的植物。然而，HD RNAi技术的效果随着靶基因的不同而变化。在寄主中高通量的表达害虫基因的长片段双链RNA(ldsRNA)并结合抗虫筛选，是获得大量理想抗虫基因的有效途径。但是，具有这些功能的高通量RNA干涉载体仍不成熟。

发明内容

本发明的目的是利用共轭启动子和LoxP及attP位点序列，提供一种高通量产生ldsRNA的载体。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体，其为整合有以下序列的植物双元表达载体：终止子-启动子-LoxP位点序列-attP1位点序列-ccdB基因-CmR基因-attP2位点序列-LoxP位点序列-启动子-终止子，是一种可高通量产生植物或病虫基因长双链RNA的高效植物表达载体。