[发明专利]复苏可培养化的VBNC节杆菌DSC4菌株及其复苏方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术农业、环境保护领域，涉及一株应用复苏可培养化技术分离到的“活的非可培养（VBNC）”节杆菌属菌种（Arthrobacter sp. DSC4）以及该菌种的复苏方法和应用。 

背景技术

含氨氮污水的生物处理是当今农业、环保行业极为重要的一项技术措施，其中氨态氮的氧化，亚硝态氮的氧化，硝态氮的还原以及脱氮等关键技术环节中需要有多种微生物的参与，降解转化无机与有机态氮素。一般传统可分离的单一功能的亚硝化细菌如Nitrosomonas、Nitrosococcus属中的菌种，硝化菌如Nitrobacter、Nitrococcus属的菌种，反硝化脱氮菌如Micrococcus denitrificans等为自养细菌，硝化反硝化作用所需时间长、效率低。筛选具备硝化反硝化功能的异养硝化细菌菌种与量化功能是目前研究的热门。 

自然界生态环境中的细菌能够经传统分离法获取的仅有0.01-10%，绝大部分处于活的非可培养（VBNC）、类似于休眠状态。就环境微生物资源而言，获取自然界中90-99.99%的资源菌种包括上述氨氮污水处理环节中的自养与异养硝化菌群需要有新思路新方法的创新，才能挖掘、开发、利用这些未知的微生物资源。 

VBNC状态细菌的分离与筛选可以利用一些特殊信号分子复苏促进其处于休眠状态细菌的可培养化。（丁林贤, 苏晓梅, 横田明. 活的但非可培养(VBNC)状态菌的研究进展及应用展望.《微生物学报》.2011, 51（7）: 858-862.） 阐述了VBNC 状态菌的形成机理、转变与种类、复苏、研究意义及其应用展望。并报道了丁林贤等在十余年间针对生态环境中处于VBNC 状态菌的复苏、可培养化、系统进化关系及潜在功能等方面的一些研究成果，拟为微生物资源的开发与应用提供新的科学依据。并公开了复活促进因子( Rpf，resuscitation promotingfactor) 是由藤黄球菌(M. luteus) 分泌的一种能使处于VBNC 状态的该菌重新恢复其生长繁殖能力的蛋白质，分子量约为16 － 17 kDa。Mukamolova报道了Rpf 可以复苏处于VBNC 时期的革兰氏阳性菌Mycobacterium 属的结核分枝杆菌(M． tuberculosis)、 

牛分枝杆菌(M． bovis )、堪萨斯分枝杆菌(M．kansasii) ，耻垢分枝杆菌(M． smegmatis) 和鸟分枝杆菌(M． avium) 等。并且同Rpf 相似的基因也在链霉菌、结核菌、棒状杆菌等高GC 的革兰氏阳性菌中被发现。另外，Mukamolova等人还报道了Rpf 采用自分泌或旁分泌的方式分泌信号，不但能使休眠的微生物复活，还可以刺激正常菌的生长，并能调控细胞的繁殖过程。

目前国内对于在污水处理系统中分离VBNC状态硝化菌群的技术以及复苏可培养化的VBNC状态的硝化细菌尚未见有公开报道。 

发明内容

根据VBNC微生物资源的挖掘利用以及针对氨氮污水生物处理亟需高效率硝化反硝化细菌资源的社会需求，本发明目的之一是提供一种复苏可培养化的VBNC节杆菌DSC4菌株，本发明目的之二是提供上述的节杆菌DSC4菌株的活化培养基，本发明目的之三是提供上述的VBNC节杆菌DSC4菌株应用于含硝酸盐基质的反硝化脱氮。 

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

复苏可培养化的VBNC节杆菌DSC4（Arthrobacter sp. DSC4）菌株，该菌株的保藏编号为CCTCC No：M2011406，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2011年11月21日。分类命名为：节杆菌DSC4  Arthrobacter sp. DSC4。上述的菌株以污水生物处理系统中的VBNC状态菌群作为分离源，利用复苏可培养化技术取得的VBNC资源细菌。该菌株在活化培养基上（本专利活化培养基配方），30℃培养2d，菌落直径2-3mm，浅灰色或淡黄色，有光泽；细胞无鞭毛、不运动；革兰氏阳性细菌。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

一种用于上述的节杆菌DSC4菌株的活化培养基，该培养基按重量百分比计有以下的组分构成：

营养肉汤培养基   1.0~3.0g ；  酵母膏0.2~0.5g；