[发明专利]重组微生物、重组载体及制备3-羟基丙酸的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年3月24日提交的韩国专利申请No.10-2011-0026531的优先权以及由其产生的所有权益，该申请的公开内容在此通过引用全部引入如同在本文中完全阐述一样。

技术领域

本公开内容涉及代谢修饰的微生物和制备该代谢修饰的微生物的方法，并涉及通过将合适的碳底物与该代谢修饰的微生物接触来制备3-羟基丙酸(“3-HP”)的方法。

背景技术

近来，由于石油价格的快速上涨以及严重的环境污染，制造生物基燃料正变得迫切。生物柴油(一种生物基燃料)通过来自植物油或动物脂肪的甘油三酯的酯交换制造。

生物柴油的大量生产已导致作为副产物的甘油的大规模生产，约77亿磅/10亿加仑生物柴油。甘油的生产增长非常迅速，且估计在美国为每年约32亿磅和在全世界为每年80亿磅。结果，甘油的价格在过去的2年里下降几乎10倍。粗甘油市场价格在2004年为5～15美分/磅，但据报道现在为低于2.5美分/磅。

比较而言，葡萄糖的价格目前为约5美分/磅并且正在逐渐提高。如果目前的趋势继续，甘油价格的持续下降可被认为是不可避免的。

微生物可利用甘油作为碳源以产生多种发酵产物。例如，3-羟基丙酸(3-HP；C₃H₆O₃-MW 90.08)(可应用于多种化学工艺的化合物)可由可再生资源如甘油制备。

3-HP可通过多种化学合成方法或生物方法制备。

制备3-HP的化学方法可包括使用钯作为催化剂由1，3-丙二醇制备3-HP的方法，在作为催化剂的钯和铂的存在下由3-羟基丙醛制备3-HP的方法，和通过丙烯酸与作为固体酸催化剂的离子交换树脂(15)在100℃下在高压反应容器中反应40小时以91％的选择性和34％的收率制备3-HP的方法。

3-HP的生物制备可例如通过光异养微生物如橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)进行。微生物自养地或光异养地生长，由此产生作为中间产物的3-HP。其它已知的由甘油制备3-HP的微生物包括Desulfovibrio carbinolicus、食果糖脱硫弧菌(Desulfovibrio fructosovorans)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、威尼斯暗杆菌(Pelobacter venetianus)、和多营养泥杆菌(Ilyobacter polytropus)。

发明内容

常规的制备3-HP的生物工艺通过复杂的代谢途径进行。因此，难以有效地控制该工艺，导致低的制备收率和生产力。为此，必须设计出不存在于体内的3-HP制备途径。

示例的实施方案提供使用重组微生物制备3-羟基丙酸(“3-HP”)的方法。不同于常规的代谢途径，本发明的方法可利用“丙二酸半醛还原途径”，其将乙酰基CoA以乙酰基CoA、丙二酰基CoA、丙二酸半醛和3-HP的顺序还原成3-HP，以及利用再利用的NADPH活性以解决氧化还原失衡，从而以显著高的收率获得3-HP。

一方面，提供用于制备3-HP的重组微生物，其具有将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的活性和将丙二酸半醛还原成3-HP的活性。

这里，将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的活性可为丙二酰基CoA还原酶(“mcr”)的活性，并且将丙二酸半醛还原成3-HP的活性可为丙二酸半醛还原酶(“msr”)的活性。

所述mcr活性和所述msr活性可为外源的。所述mcr活性和所述msr活性都可源自勤奋金属球菌(M.sedula)。

为了解决微生物代谢过程中氧化和还原之间的失衡，可进一步包括NADPH再生活性。

这里，NADPH再生活性可为转氢酶活性或甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性。

转氢酶活性可为吡啶核苷酸转氢酶(“pntAB”)活性或可溶性吡啶核苷酸转氢酶(“udhA”)活性。pntAB活性可源自大肠杆菌(E.coli)。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性可为非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶(“gapN”)活性，其可源自变异链球菌(S.mutans)。