[发明专利]一种抗盐胁迫基因CbCRT1、制备方法以及其编码产物的氨基酸序列

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种高山离子芥抗盐胁迫基因CbCRT1、其编码产物CbCRT1的氨基酸序列，以及基因CbCRT1制备方法。

背景技术

西北地区的70%的土地为贫瘠土壤，其中高盐碱土壤又占了近一半，这导致大多数植物很难生存，这就进一步限制了农民的可用耕地面积 （于法稳，2001）。因此，选育具有抗盐特性的作物就变得非常重要。但是，由于缺乏合理的筛选手段和技术，且随机选育所需的人力物力都十分巨大，目前筛选得到的具有抗盐特性的作物数量很少，且抗性不强。

近些年来，科学家发现了一些能在高盐碱土壤上生长的抗盐胁迫植株，并将该植株中抗盐胁迫相关的基因进行克隆获得具有抗盐胁迫能力的转基因作物（傅宣英，2006）。至今公开的抗盐胁迫基因的数量也很少。

钙网织蛋白基因（Calreticulins，CRTs）是一种内质网上的钙离子结合蛋白基因 （Michalak et al 2002），其次，CRT还是一个重要的分子伴侣 (Trombetta 2003)。研究表明，CRTs在植物中的功能主要有四大方面：参与内质网上蛋白质翻译后的折叠；是细胞内 Ca²⁺信号的重要连接体（Zhu et al.,1997, Kwon et al., 2000），调节胞内 Ca²⁺的内稳态（Fraser et al. 2000）；参与调节植物生长发育，免疫应答（Dupuis et al., 1993, Andrin et al., 1998）；是植物逆境响应（盐碱、低温）的重要调节因子。

高山离子芥（Chorispora bungeana）是十字花科离子芥属多年生植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、高盐碱、空气稀薄、辐射强、劲风。高山离子芥在我国主要分布于乌鲁木齐河源区流石碓，该地区海拔3600～3900 m。年平均气温在-5～-7 ℃之间，6～8月平均气温为3.6 ℃，气温日差较大，是一种伴随反复冻融的冰冻环境。并且处于迎风坡，流石碓中砾石保水性差，时常造成干旱胁迫。高山离子芥在外部形态结构和生态策略上没有显著的抗性特征，为了耐受长期低温、高盐碱、强紫外、大风和生理干旱，适应这些不利的环境条件，势必通过表达抗性基因来维持自身的生理代谢和生长发育，以避免或减轻严酷的环境胁迫的危害。由于高山离子芥处于极端环境（高盐碱、低温、高辐射等），积累了适应极端胁迫的有益突变，所以克隆和研究高山离子芥的抗盐胁迫的钙网织蛋白基因CbCRT1将会为构建具有抗盐胁迫能力的转基因植株提供物质基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的高山离子芥抗盐胁迫基因CbCRT1。基因CbCRT1的克隆和研究能够扩大抗盐胁迫基因资源，从而为制备抗盐胁迫转基因植株的需要及基因工程改造的需要，提供更加丰富的优良候选基因。

本发明的另一个目的在于提供一种由抗盐胁迫基因CbCRT1编码的蛋白CbCRT1。

本发明的又一个目的在于提供一种高山离子芥抗盐胁迫基因CbCRT1的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明用RACE法扩增得到高山离子芥钙网织蛋白基因CbCRT1的cDNA全序列。CbCRT1全长1495bp，包含一个1272个碱基的开放阅读框（ORF），并含有一个长度为180个碱基的5‘非编码区和一个长度为187个碱基，包含poly（A）的3’非编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。基因CbCRT1编码得到的蛋白CbCRT1长度为424 氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

通过序列同源性分析得知：高山离子芥钙网织蛋白基因CbCRT1与拟南芥钙网织蛋白基因AtCRT1同源性为96%（图1）。

本发明对盐胁迫诱导CbCRT1基因进行了鉴定。利用150 mM NaCl处理高山离子芥悬浮细胞0 h，1 h，3 h，6 h，12 h后，提取植物总蛋白，通过West Blotting法检测CbCRT1蛋白表达量的变化。结果显示（图2），NaCl处理能显著增强 CbCRT1蛋白表达，而且CbCRT1参与了高山离子芥对NaCl胁迫的响应。