[发明专利]一种新的分枝杆菌菌种快速鉴定方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及利用核酸扩增及其检测体系，在临床检查中检测和/或鉴定分枝杆菌菌种的方法和试剂盒，属于医学分子生物学诊断技术领域。

背景技术

结核病仍然是严重的公共卫生问题，尤其是在发展中国家。据WHO统计世界人口的1/3有结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染，是全世界感染性疾病中的第一大杀手。我国是全世界22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。目前我国全年龄组结核菌感染率为44.5％，全国约5.5亿人受到结核菌感染。同时，非结核分枝杆菌(NTM)病也呈逐年上升趋势，2000年，卫生部组织的调查数据显示，NTM菌株分离率上升至11.1％，NTM病临床表现与结核病相似，在无菌种鉴定结果的情况下，经常被误诊为结核病。大量研究及临床治疗病例表明非结核分枝杆菌对大多数一线抗结核药物具有天然耐药性，采用目前标准的化疗方案治疗无效。目前，非结核分枝杆菌病通常依据传统的分枝杆菌菌种鉴定来确诊，然而，传统的分枝杆菌菌种鉴定繁琐、费时，需1～2个月的时间，不能满足临床开展早期有效治疗的需要，使非结核分枝杆菌病人通常被作为结核病人按常规治疗，病人经长期常规治疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治病人，细菌在局部播散。因此，分枝杆菌菌种的快速鉴定对结核病和非结核分枝杆菌病的早期诊断、鉴别诊断、有效治疗和控制传播都有重要意义。

传统诊断临床标本的分枝杆菌感染是基于镜下抗酸染色，进而特殊培养及生化实验鉴定菌种，最后检测药物敏感性。抗酸染色只能鉴别属与属外的特征，且只有在标本带菌量在10⁴/ml以上时才能看见。由于多数分枝杆菌生长缓慢，鉴别到种的水平需要耗时4～8周，且影响因素多，重复性差。近年来，一直在开发于基因水平鉴定分枝杆菌菌种的技术，主要是利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)等核酸扩增技术的诊断技术。

目前利用PCR鉴定分枝杆菌菌种的方法主要是通过PCR扩增目标片段后，通过膜杂交或基因芯片检测，但这些方法普遍存在一些问题，不适合在临床上开展。(1)PCR菌种鉴定法。用各种分枝杆菌特异性引物对标本DNA进行一系列PCR扩增或多重PCR扩增，根据扩增产物所产生的特异性片段进行鉴定；或先用分枝杆菌属特异的外部引物扩增，然后再用菌种特异的内部引物进行巢氏扩增鉴定。该法灵敏、快速，但目前能够鉴定的菌种尚不多，主要有结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，而且鉴定未知的感染菌，需采用一系列种特异性引物进行扩增。(2)PCR-直接测序鉴定法。用分枝杆菌属特异的引物对标本的16SrRNA或16S-23S rRNA间隔区序列或65kD或32kD抗原基因进行PCR扩增，然后直接测定扩增产物的核苷酸序列，比较其核苷酸的差异来鉴定菌种。但该方法无法鉴别少数分枝杆菌，而且技术要求高，需昂贵的特殊仪器，而难以推广。(3)PCR-DNA探针鉴定法：用分枝杆菌属特异的引物对标本中分枝杆菌16S或16S-23S rDNA进行扩增，然后与各种分枝杆菌特异的寡核苷酸探针进行反向斑点杂交或微孔板反向杂交鉴定菌种。该法较灵敏、快速，但目前只能鉴定部分菌种。(4)PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定法。PCR-RFLP菌种鉴定法是以分枝杆菌属特异性引物对标本中分枝杆菌65KD蛋白编码基因、16S或16-23S rDNA进行扩增，然后用不同的限制性内切酶消化扩增片段，通过电泳分析酶切图谱来鉴定菌种。目前只能鉴定部分菌种，重复性还不够理想。(5)PCR-基因芯片鉴定法。基因芯片技术是指将大量核酸分子以预先设计的方式固定在载体上，检测带标记的待测样品DNA，是一种大规模分析遗传差异的新方法。但这种方法操作复杂，易造成交叉污染，所需的点样系统和荧光分析系统昂贵，而难以推广应用。

近年来出现的实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。本发明利用荧光定量PCR技术平台结合双标记探针熔解曲线技术进行分枝杆菌菌种鉴定，实现了快速、简单、灵敏、高效、廉价的分枝杆菌菌种鉴定的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简单、灵敏、高效、廉价的分枝杆菌菌种鉴定的方法，以及利用所述方法同时鉴定多种分枝杆菌菌种的试剂盒。