[发明专利]传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的制备方法

权利要求书

1.一种传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a. 传染性造血器官坏死病毒RNA的提取

在离心管中加入Trizol裂解液600μl，传染性造血器官坏死病毒细胞培养物200μl，加入氯仿200μl震荡混匀，10 000 g离心15min；吸取上清液500 μl加入到500μl异丙醇中，反复颠倒混匀，10 000 g离心15min；弃去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入75%的酒精600μl，颠倒洗涤，10 000 g离心10min；弃去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；4 000g离心10sec，吸干管底的液体，室温干燥3 min；加入11.5 μl的DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁内的RNA，2 000g离心5sec，4℃保存，做为模板备用；

b. RT-PCR反应 

b-1．反转录体系

5×M-MLV Buffer 4μl，dNTPs（各2.5mmol/L） 2μl，M-MLV（5U/μl）1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，反转录引物（20pmol/μL）1μl，a步骤所得RNA模板11.5μl；所述反转录游引物是5’-TCAAGGGGGGAGTCCTCGA-3’，总反应体系为20μl；

b-2．反转录条件

42℃水浴1h~2h；

b-3．PCR扩增反应体系

10×PCR Buffer（含Mg²⁺）2.5μl，dNTPs（各2.5mmol/L） 0.5μl，Taq DNA聚合酶（5U/μl）1μl，上游引物、下游引物（20pmol/μL）各1μL，b-2的反转录产物0.5μl，用无菌水补充至25μl；

所述上游引物是5’-TCAAGGGGGGAGTCCTCGA-3’；

所述下游引物是5’-CACCGTACTTTGCTGCTAC-3’；

b-4. PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃ 5min；

c. 目标基因的纯化

采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒，回收目标分子DNA片段；

d. 目的片段的连接转化

d-1连接体系

c步骤所得到的纯化的目的片段4μl，2×Rapid ligation buffer 5μl，PGEM-T载体0.5μl，T4 DNA Ligase 0.5μl，室温连接1h；

d-2 转化

将上一步骤的连接产物加入到感受态细胞中，混匀，冰浴20min，42℃热应激1min，冰浴2min，加入800μl SOC培养基，150g摇菌1.5h，1 000g离心10min，弃去培养液，加入新鲜的SOC培养基200μl，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37℃倒置培养12h~16h；

d-3 阳性克隆的筛选

挑取单克隆菌进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系及反应条件如b-3、b-4；

e. 回收质粒；

f. 体外转录

将e步骤所得质粒用SalI进行单酶切，反应体系为：10×H Buffer 5μl，SalI 1μl，质粒 10μl，双蒸水 34μl；37℃2h，用Omega回收试剂盒回收线性化质粒；转录反应体系为：10× T7 RNA polymerase buffer 5μl，DTT 5μl，NTP 10μl，Rnasin 1μl，线性化质粒5μl，T7 RNApolymerase 1μl，DEPC处理水28μl；37℃2h，然后再加入10U DnaseI 2μl，37℃，30min；

g. 转录后RNA 纯化处理 

对转录的 RNA 进行 DNase 处理，反应体系及条件如下：所述f步骤的转录反应液20ul、RNase free DNaseⅠ（5u/ul）4 ul、Total 24ul，37℃ 1h； 

h. 酚氯仿抽提  

对所述g步骤经DNase处理的反应液进行酚氯仿抽提，最终用 RNase-free dH2O补足至 100 ul。