[发明专利]传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒分子标准样品的制备方法，尤其是一种省时省力、稳定性高、均匀性好的传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的。

背景技术

传染性造血器官坏死病毒属弹状病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）科的粒弹状病毒属（Novirhabdovirus），同属的水生动物病毒还有牙鲆弹状病毒（Hirame rhabdovirus，HRV）、鳢弹状病毒（Snakehead rhabdovirUS，SRV）和病毒性出血性败血症病毒（Viral haemorrhagic septicaemia，VHSV）。IHNV是该属的代表种，IHNV的代表株是WRAC株（ATCC编码为VR一1392），病毒粒子形态为弹状，直径 80~90 nm，长度为160~180 nm，有囊膜；病毒核酸在硫酸铯中的浮密度为1.59 g／ml，对热、酸、乙醚不稳定。

传染性造血器官坏死病（Infectious haematopoietic necrosis，IHN）是鲑、鳟等鱼类中的一种严重的传染性疾病，由于该病毒造成的危害极大，OIE将其列为重要传染病。我国是一个渔业大国，鲑鳟鱼类作为一种大型经济鱼类，在我国水产养殖业中占有相当重要的地位，同时进口的鲑鳟鱼量逐年增加，而传染性造血器官坏死病也被带入了我国，1990年，辽宁本溪首次报道了传染性造血器官坏死病在我国爆发。为了保护我国水产养殖业健康发展，需要对进口鲑鳟鱼类进行严格检验避免病毒流入，以及对国内已发现该病的养殖场进行疫情控制、防止疫情的传播恶化。在过去的十几年中，一些用于检测感染和非感染状态的 lHNV的方法主要包括用核蛋白基因特异性的探针进行原位杂交、免疫组织化学、在体内进行检测的免疫金标记方法、ElISA和 RT-PCR，在这些方法中，PCR被证明是最迅速和最灵敏的方法。但是，由于该病毒属于RNA病毒，其RNA极其容易被降解，各自实验室提取RNA病毒，不但费时费力，而且很难保持其稳定性和均匀性，难以保证实验室的质量控制。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种省时省力、稳定性高、均匀性好的传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a. 传染性造血器官坏死病毒RNA的提取

在离心管中加入Trizol裂解液600μl，传染性造血器官坏死病毒细胞培养物200μl，加入氯仿200μl震荡混匀，10 000 g离心15min；吸取上清液500 μl加入到500μl异丙醇中，反复颠倒混匀，10 000 g离心15min；弃去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入75%的酒精600μl，颠倒洗涤，10 000 g离心10min；弃去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；4 000g离心10sec，吸干管底的液体，室温干燥3 min；加入11.5 μl的DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁内的RNA，2 000g离心5sec，4℃保存，做为模板备用；

b. RT-PCR反应 

b-1．反转录体系

5×M-MLV Buffer 4μl，dNTPs（各2.5mmol/L） 2μl，M-MLV（5U/μl）1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，反转录引物（20pmol/μL）1μl，a步骤所得RNA模板11.5μl；所述反转录游引物是5’-TCAAGGGGGGAGTCCTCGA-3’，总反应体系为20μl；

b-2．反转录条件

42℃水浴1h~2h；

b-3．PCR扩增反应体系

10×PCR Buffer（含Mg²⁺）2.5μl，dNTPs（各2.5mmol/L） 0.5μl，Taq DNA聚合酶（5U/μl）1μl，上游引物、下游引物（20pmol/μL）各1μL，b-2的反转录产物0.5μl，用无菌水补充至25μl；

所述上游引物是5’-TCAAGGGGGGAGTCCTCGA-3’；

所述下游引物是5’-CACCGTACTTTGCTGCTAC-3’；

b-4. PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃ 5min；

c. 目标基因的纯化