[发明专利]一种可循环提取发酵液中AD和/或ADD的工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物分离工程领域，具体涉及一种利用循环萃取工艺连续提取发酵液中AD和/或ADD的工艺。 

背景技术

雄甾-4-烯-3.17-二酮（androst-4-ene-3,17-dione，简称雄烯二酮、AD ）和雄甾-1,-4-二烯-3.17-二酮（androsta-1,4-diene-3,17-dione，简称雄二烯二酮、ADD）均是重要的甾类药物中间体，绝大多数的甾体激素类药物都是以AD和/或ADD作为基础原料进行生产的。 

到目前为止，AD及ADD的制备方法主要是化学合成法和微生物转化法。由于化学合成法耗材多、污染大、成本高，所以微生物降解植物甾醇转化法成为主流。到目前为止，分枝杆菌（Mycobacterium） MB3683和MB3605是比较常用的AD和/或ADD的生产菌株，常规的生产方法是先在适当的培养基中培养菌体，然后将菌体移至含有甾醇类物质的发酵罐中，经过大约120-168小时的生物转化生产AD和/或ADD，然后用适当的有机溶对AD和/或ADD进行萃取、分离、结晶并精制，即可得到白色的结晶粉末状的AD和/或ADD。 

受限于甾醇类物质在水溶性的培养基中的溶解度，微生物对甾醇的利用率低，因而导致发酵周期较长，且AD和/或ADD的有效转化率不高。针对上述问题，现有技术中一般都采用双相发酵系统，即有机相--水相发酵系统，生物转化后的AD和/或ADD集中在有机相，而水相中几乎没有AD和/或ADD，发酵结束后采用现代萃取技术将AD和/或ADD分离出来，然后进行纯化和结晶，即成为产品。 

在现有的制备AD和/或ADD的工艺中，存在两个亟待解决的问题： 

一、现有技术中，发酵液中的AD和/或ADD的提取一般均是先采用分批萃取的方法，采用有机溶剂对发酵液有机相进行多次的萃取后，再分别合并每次萃取的萃取液，整体进行减压回收溶剂后即得所需的AD和/或ADD的粗品。中国专利文献CN1639354A中的萃取ADD的实施例中，公开了先用6L的乙酸乙酯加入到含16%V/V油相的3L发酵液中，振荡分层，并移出乙酸乙酯层；再向移出的水层中加入4L的乙酸乙酯，再进行振荡分层，再移出乙酸乙酯层，合并两次移出的乙酸乙酯层，减压回收乙酸乙酯，得到0.45L油层。并向油层中加入1.25L正己烷混匀，随后用2.0L的甲醇萃取油--正己烷混合溶液两次，并将两次得到的萃取液合并且蒸干，得到50g纯度为30-40%的ADD粗品，粗品颜色为黄褐色。中国专利文献CN1712410A公开了一种用乙醇为溶剂萃取AD的方法，该方法先加盐将发酵液进行油水分层处理，并收集油相，随后用1：1（V/V）的乙醇对油相进行分批萃取4～5次，收集每次萃取操作得到的乙醇萃取液，蒸干并回收乙醇，得到AD粗品，然后再进行后续的粗品结晶及纯化。以上涉及的萃取AD和/或ADD的方法均是采用分批萃取的方式，分批萃取需要经过多次萃取才能将AD和/或ADD萃取完全，不仅需要消耗很大量的溶剂，而且需要大容积的萃取设备才能完成，此外，回收溶剂的能耗较大，如果涉及的溶剂种类较多则会造成回收步骤复杂，溶剂在萃取过程损失率大，不利于大规模的生产的成本控制等问题。

二、经过多次分批萃取后的粗品的后续除杂质和精制纯化的工艺流程比较复杂，而且收率较低。中国专利文献CN1639354A中提及到的精制ADD的方法中，50g含量为40%的ADD粗品经过三次重复结晶操作才得到14g左右的纯化成品，收率仅为不到30%、收率较低；而且整个精制纯化的过程步骤比较繁琐，整个工艺涉及的溶剂种类较多，且用量较大，溶剂回收的工艺复杂，不利于大规模的生产。而中国专利文献CN1712410A中提到的精制AD的方法中，20kg的粗品经过溶解、结晶、再溶解、再结晶的两次重复操作，也只得到8kg的成品，收率也只能达到40%。