[发明专利]一种重组胸腺肽α1的制备方法

权利要求书

1.一种重组胸腺肽α1的制备方法，包括以下步骤：

1)人工合成胸腺肽α1的融合蛋白基因全序列，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示；

2)将合成的基因酶切后，重组到质粒pet-22b上构建表达载体，并将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中构建工程菌；

3)将工程菌发酵培养，以乳糖作为诱导剂诱导融合蛋白表达；

4)将步骤3)获得的表达产物按下述步骤进行纯化，制备重组胸腺肽α1；

4a)收集经发酵培养的工程菌，悬浮菌体，用超高压均质机破碎，得细胞破碎液；

4b)用中空纤维滤膜过滤细胞破碎液，得滤液I；

4c)滤液I经亲和层析后，再经超滤，得滤液II；

4d)用肠激酶水解滤液II后，用亲和层析和HPLC纯化出胸腺肽α1。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述纯化包括以下步骤：

4a)收集经发酵培养的工程菌，用10倍重量的50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5MNaCl，20mM咪唑溶液重新悬浮菌体，然后用超高压均质机破碎，得细胞破碎液；

4b)用孔径0.1μm～0.65μm的中空纤维滤膜过滤细胞破碎液的上清液，并洗滤3～5倍体积得滤液I；

4c)用50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑的缓冲液平衡亲和层析柱，将滤液I上柱，弃去穿透液，然后再以50mM Tris-HCl(pH 7.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑的缓冲液平衡层析柱，以Tris-HCl(pH 7.0)，0.5M NaCl，150mM咪唑的缓冲液洗脱，收集融合蛋白峰流出液，以截留分子量为5KD或10KD的超滤膜超滤除去流出液中的咪唑，并将其中的缓冲液置换为20mmol/LTris-HCl，pH8.0，20mM NaCl的缓冲液，得滤液II；

4d)测定滤液II的蛋白质浓度，以1μl肠激酶切割4mg融合蛋白的比例加入肠激酶，于15℃水解16小时，用50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5M NaCl的缓冲液平衡亲和层析柱，将融合蛋白水解液上柱，收集穿透液，并将其中的缓冲液置换成超纯水，然后用HPLC纯化出胸腺肽α1。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述发酵包括以下步骤：

3a)将步骤2)构建的工程菌于培养基中培养获得活化的种子菌；

3b)将活化的种子菌进行高密度发酵培养，培养过程中加入补碳液和补氮液，以盐酸-氨水调节pH，加入乳糖诱导剂培养获得含表达的胸腺肽α1的菌体；其中补碳液含葡萄糖、MgSO₄·7H₂O和甘油，补氮液含蛋白胨，酵母粉和硫酸铵。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3b)包括：

i)向发酵罐中加入发酵培养基，每升发酵培养基组成为：蛋白胨11.43g，酵母粉14.3g，NaCl 8.57g，KH₂PO₄6.43g，K₂HPO₄7.14g，MgSO₄·7H₂O 1.71g，葡萄糖10g，按体积比1∶25向发酵培养基中加入活化种子菌，另加入消泡剂，于37℃，pH7.0的条件下发酵；

ii)控制发酵过程的溶解氧浓度为30％～60％，转速为300-800rpm，自动流加2N的HCl或氨水将发酵液的pH调节至7.0；

iii)加入种子菌后3hr时至诱导前30min，连续向发酵罐加入补碳液，每升补碳液组成为：葡萄糖312.5g，MgSO₄·7H₂O 12.5g，甘油150g；

iv)加入种子菌后4hr至诱导完毕前1hr，连续向发酵罐加入补氮液，每升补氮液组成为：蛋白胨65g，酵母粉65g，硫酸铵65g；

v)加入种子菌后6hr一次性加入乳糖进行诱导，使乳糖终浓度为10mM，诱导4hr后收集菌体。