[发明专利]一种重组胸腺肽α1的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物工程技术领域，具体涉及一种重组多肽的制备方法。

背景技术

胸腺肽α1是Goldstein等1977年首次在胸腺组织中发现的由28个氨基酸组成的多肽，天然胸腺肽α1的氨基酸序列为：NH₂-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH。胸腺肽α1具有免疫调节功能，是一种广谱免疫调节剂，临床上用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎及肿瘤等疾病。此外，还可以用作疫苗辅助制剂。

目前，胸腺肽α1的生产方法有化学合成法和基因工程法。化学合成法的成本高，使用有机溶剂多，易造成环境污染。基因工程法是通过构建能表达胸腺肽α1的工程菌株(如大肠杆菌、酵母菌等)，在发酵阶段进行诱导表达，再经过纯化工序而制得胸腺肽α1。中国专利(专利号ZL200410077749.2)公开了一种通过基因工程技术制备胸腺肽α1的方法，该方法在pTRX质粒的基础上构建表达菌株，发酵中采用IPTG诱导工程菌表达，再采用亲和层析、离子交换层析纯化融合蛋白，肠激酶切释放出胸腺肽α1，再通过亲和层析和HPLC纯化出胸腺肽α1。

但该方法存在成本高、无法大规模生产等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、成本低、收率高且适用于大规模生产的重组胸腺肽α1的制备方法。

本发明利用基因重组技术制备重组胸腺肽α1，包括人工合成融合蛋白基因并将所述融合蛋白基因重组到载体质粒pet-22b中构建表达载体，将该表达载体转化到宿主大肠杆菌中构建工程菌，将所述工程菌进行发酵并诱导融合蛋白表达，对表达产物进行纯化制备后得到融合蛋白目标产物。

本发明的具体技术方案为：

一种重组胸腺肽α1的制备方法，包括以下步骤：

1)人工合成胸腺肽α1的融合蛋白基因全序列，如SEQ ID NO.1所示；

2)将合成的基因酶切后，重组到质粒pet-22b上构建表达载体，并将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中构建工程菌；

3)将工程菌发酵培养，以乳糖作为诱导剂诱导融合蛋白表达；

4)将步骤3)的表达产物进行纯化，制备重组胸腺肽α1。

其中，步骤3)所述的发酵培养包括：

3a)将步骤2)构建的工程菌于培养基中培养获得活化的种子菌；

3b)将活化的种子菌进行高密度发酵培养，培养过程中加入补碳液和补氮液步骤4)所述的纯化包括以下步骤：

4a)收集经发酵培养的工程菌，用超高压均质机破碎，得细胞破碎液；

4b)用中空纤维滤膜过滤细胞破碎液，得滤液I；

4c)滤液I经亲和层析后，再经超滤除去咪唑，得滤液II；

4d)用肠激酶水解滤液II后，用亲和层析和HPLC纯化出胸腺肽α1。

进一步地，上述滤液II在15～20℃条件下，用肠激酶水解16hr。在所述条件可以减少肠激酶对胸腺肽α1的非特异性切割，有效提高胸腺肽α1的产量。

本发明的制备方法适用于大规模的工业化生产，不但显著提高了重组胸腺肽α1的产率，而且还具有制备工艺简单、生产成本低等有益效果。

附图说明

图1是实施例5所得胸腺肽的纯度和浓度的HPLC分析图。

图2是实施例6所得胸腺肽的纯度和浓度的HPLC分析图。

图3是实施例8中肠激酶水解融合蛋白的SDS-PAGE分析图；

其中，泳道1为胸腺肽α1对照品、泳道2-6的水解温度分别为：25℃、20℃、18℃、15℃、12℃。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明重组胸腺肽α1的制备方法进行详细描述。

表达载体的构建

【实施例1】

1、试剂和材料

载体质粒pet-22b购自美国MERK公司，大肠杆菌BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)公司，融合蛋白基因的合成及质粒的测序委托生工生物工程(上海)有限公司合成，T4DNA连接酶、DNA限制性内切酶Nde I和Not I购自生工生物工程(上海)有限公司，胶回收试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。

2、方法

(1)融合蛋白基因