[发明专利]水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法

权利要求书

1.一种水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法，包括：

(1)将水稻白叶枯病菌BAI3^R的基因组DNA和含有avrBs3/pthA家族基因的BAI3^R cosmid文库质粒分别用限制性内切酶BamHI完全消化，所得片段用0.8％琼脂糖凝胶分别电泳分离；以avrBs3/pthA家族基因avrXa7中的第122至842碱基片段为探针，对分离得到的DNA片段进行Southern杂交，确定cosmid文库质粒中携带的avrBs3/pthA家族基因与基因组中avrBs3/pthA家族基因的对应情况，同时估计该avrBs3/pthA家族基因含有重复单元数目n；

(2)将cosmid文库质粒中与Southern杂交中条带对应的BamHI条带切下，并回收DNA片段；将该BamHI条带中DNA片段克隆到用BamHI消化过的载体pWEB-TNC中，得到pWEB-tal质粒；

(3)将pWEB-tal与EZ-Tn5^TM Transposase混合，其中pWEB-talC 2μg，EZ-Tn5^TM Transposase 1U，10X反应缓冲液1μl，37℃下反应两个小时；反应结束时加入1μl反应中止液，70℃下温浴10分钟以中止反应；

(4)取1/10上述反应液，用化学转化方法转化到大肠杆菌DH5α菌株中，并筛选其中缺乏氯霉素抗性且有氨苄青霉素抗性的克隆；

(5)提取上述克隆的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI完全消化，并用1％琼脂糖凝胶分析酶切图谱；有单一或两个外源片段的克隆均可用于测序分析；

(6)选取等于或超过重复单元数目n个数的克隆，提取质粒，用位于pWEB-TNC上靠近复制起始位点的反向引物进行测序，对每个克隆测一个反应；

(7)将含有两个外援片段的克隆的测序结果进行反向互补转化，然后与含有单一外源片段克隆的测序结果综合，依据序列间的相似性将测序结果排序、组装，最终得到BamHI片段的完整序列；

(8)以BamHI片段序列为模板，在其5′端设计反向引物，在其3′端设计正向引物，以对应cosmid为模板对avrBs3/pthA家族基因的5′端、3′端进行测序，所得结果和BamHI片段序列拼合，最终的到avrBs3/pthA家族基因的全长序列。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)选取等于或超过重复单元数目n个数的克隆，提取质粒，用位于pWEB-TNC上靠近复制起始位点的反向引物进行测序，具体是指：

选取酶切图谱中25个含有一个或两个外源片段的克隆，提取质粒，用位于pWEB-TNC上的引物5′TGTGAAATTTGTGATGCTATTGCT 3′进行测序。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)以BamHI片段序列为模板，在其5′端设计反向引物，在其3′端设计正向引物，以对应cosmid为模板对avrBs3/pthA家族基因的5′端、3′端进行测序，具体是指：

以BamHI  片段序列为模板，分别设计引物5′TGCAGATCGTGGGGTGTCTG3′和5′GGCTGTCGAGGTGCGCGTTC3′用以对talC的5′端、3′端进行测序。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所得片段用0.8％琼脂糖凝胶分别电泳分离，即在30V电压下电泳分离20小时。