[发明专利]水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及水稻白叶枯病菌转录激活因子样(TAL，Transcription Activator-Like)效应物基因的测序方法。 

背景技术

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，简称Xoo)既是水稻的重要病原菌，也是研究细菌与植物相互作用机理的模式细菌之一。该菌的TAL效应物，也称AvrBs3/PthA家族蛋白，是主要的致病和致敏因子。该类蛋白的最大特点是能够特异地识别DNA序列，从而激活或抑制相关基因的表达。 

AvrBs3/PthA家族蛋白是一类进化程度较高的生物大分子，家族成员间氨基酸序列同源性达80％～97％，它们在结构上也有许多共同特点，如图1所示，中间区域(即重复区Repeat region)是几乎一样的34个或35个氨基酸(aa，amino acid)重复单元的重复，不同效应蛋白间的差异主要是重复单元的重复数目和每个重复单元的第12和第13位氨基酸，决定了其毒性和专化性；其C端(右侧)和N端(左侧)高度保守，C端含有1个亮氨酸拉链结构(LZ，Leucine Zipper)、3个核定位信号(NLSs，Nuclear Localization Signals)和1个真核生物酸性转录激活区域(AAD，Acid Transcriptional Activation Domain)；N端含有一个三型分泌系统分泌信号(TTS)。 

实验证明，TAL效应物能够通过三型分泌系统(Type III secretion system，简称T3SS)进入植物的细胞，通过核酸定位信号(NLS，Nucleic acid positioning Signal)进入寄主细胞核，利用自身第12位和第13位的氨基酸(RVD，repeat variable diresidue)靶标植物细胞中特定基因启动子的UPA(upregulated by AvrBs3)区，诱导其表达，以控制植物的生理生化进程。病原菌通过进化产生一系列的TAL效应物，以利于该病原菌在寄主上的定殖和 传播；而植物亦进化出一系列的抗病策略以抑制该病原菌引起的病害。因此针对不同的寄主植物的基因型，TAL效应物既有可能是毒性因子，也有可能是无毒因子。 

近年来关于黄单胞菌的蛋白类效应物TAL效应物的研究有许多新进展，尤其是TAL效应物与寄主DNA特异性识别的分子密码的破解，将在生物工程领域、遗传病靶向治疗和植物抗病育种应用上产生重要作用。 

TAL效应物家族基因是目前已知进化多样性最高的基因类群之一，以典型的TAL效应物基因avrBs3为例，该基因全长3495bp，其5’端最前端编码一个三型分泌信号功能域，该基因的3’端，从第3061到第3495个碱基为含有编码三个真核生物细胞核定位信号和一个真核生物转录激活功能域的区域；avrBs3的中部(第865至第2658个碱基)为一个由17.5个同源性极高的重复单元组成的重复区，每个重复单元含有102个碱基。事实上，TAL效应物家族基因间的同源性很高，几乎每个基因在5’端和3’端各有一个很保守的BamHI酶切位点，详细可参见后附序列表(包括talC DNA序列和talC蛋白质序列)。不同TAL效应物家族基因间的区别主要在于重复区重复单元个数以及每个重复单元编码第12、13位氨基酸的碱基的差异，而正是这样的差异，直接影响到TAL效应物功能的特异性。在已知的TAL效应物家族基因中，重复区含重复单元数目从1.5到33.5个不等，而大多数基因含有17.5±2个重复，如此多的高度相似的重复给实验室常用的基于PCR反应的亚克隆带来极大的困扰；而且由于大多数TAL效应物家族基因的重复区长度大于1kb，使得直接利用Sanger测序方法对全基因进行测序变得异常困难。 

TAL效应物与寄主靶标序列互作机理的解码，不仅推进了水稻白叶枯病菌的致病机理、小种进化机制和抗病育种研究，而且为人类靶向治疗遗传疾病提供了新的选择。TAL效应物基因家族成员具有几乎一样的5′端和3′端，不同的只是中间102bp重复单元的重复数不同，而且在一个细菌的基因组中存在多个共生同源基因(paralogous gene)。该类基因的结构特点，以及多拷贝问题给TAL效应物基因家族的测序和基因克隆带来不便，从而不能为TAL效应物的功能性研究及应用提供了必不可少的支持。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法，能够精确地对TAL效应物进行测序。 

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法，包括：