[发明专利]美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法有效
申请号: | 201210087961.1 | 申请日: | 2012-03-29 |
公开(公告)号: | CN102605085A | 公开(公告)日: | 2012-07-25 |
发明(设计)人: | 吴佳教;胡俊韬;李志江;顾渝娟;刘海军;李春苑;胡学难 | 申请(专利权)人: | 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心;中国农业大学 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 510600 广东省广州市*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 美洲 斑潜蝇 南美 三叶草 鉴定 方法 | ||
1.一种美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法,其特征在于:所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法是根据美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的mtDNA COI序列分别合成各自的特异引物,以所述三种斑潜蝇基因组DNA为模板,分别同时进行使用相同模板但引物不同的三次PCR扩增获得各自的PCR反应产物,
取各自的PCR反应产物,在琼脂糖凝胶、电泳缓冲液中电泳检测,且染色后,在凝胶成像系统中观察并成像,同时,对扩增中出现特异性条带的扩增产物直接判定为相应特异引物扩增的针对种,
如果在使用美洲斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带,且其分子量大小为250-500bp且包括端值,确定该斑潜蝇为美洲斑潜蝇;如果在使用南美斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带,且其分子量大小为550-600bp且包括端值,确定该斑潜蝇为南美斑潜蝇;如果在使用三叶草斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带,且其分子量大小为450-550bp且包括端值,确定该斑潜蝇为三叶草斑潜蝇。
2.根据权利要求1所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法,其特征在于:所述确定斑潜蝇为美洲斑潜蝇中的美洲斑潜蝇特异引物的PCR反应产物分子量大小为270bp,所述确定斑潜蝇为南美斑潜蝇中的南美斑潜蝇特异引物的PCR反应产物分子量大小为570bp,所述确定斑潜蝇为三叶草斑潜蝇中的三叶草斑潜蝇特异引物的PCR反应产物分子量大小为480bp。
3.根据权利要求1所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法,其特征在于:所述确定斑潜蝇为美洲斑潜蝇中的美洲斑潜蝇特异引物的PCR反应产物分子量大小为480bp,所述确定斑潜蝇为南美斑潜蝇中的南美斑潜蝇特异引物的PCR反应产物分子量大小为590bp,所述确定斑潜蝇为三叶草斑潜蝇中的三叶草斑潜蝇特异引物的PCR反应产物分子量大小为500bp。
4.根据权利要求1所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法,其特征在于:所述确定斑潜蝇为美洲斑潜蝇中的美洲斑潜蝇特异引物的PCR反应产物分子量大小为410bp,所述确定斑潜蝇为南美斑潜蝇中的南美斑潜蝇特异引物的PCR反应产物分子量大小为550bp,所述确定斑潜蝇为三叶草斑潜蝇中的三叶草斑潜蝇特异引物的PCR反应产物分子量大小为520bp。
5.根据权利要求1所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法,其特征在于:所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的mtDNA COI序列是:美洲斑潜蝇GBDP4555-08,南美斑潜蝇GBDP4553-08,三叶草斑潜蝇GBDP4554-08。
6.根据权利要求5所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法,其特征在于:所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇各自合成的特异引物是通过对获得的各自序列采用DNAMAN软件进行序列比较,获得三种斑潜蝇在相同区段序列中不同的碱基位点作为特异引物的合成依据。
7.根据权利要求1所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法,其特征在于:所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的合成各自的特异引物均由上游引物与下游引物构成,各斑潜蝇特异引物序列如下:
美洲斑潜蝇LS:
上游引物LS344F17:5’-ACCCTCCACTTTCTTCA-3’,下游引物LS733R19:5’-TTTTACCTGATTCGTGACT-3’;
南美斑潜蝇LH:
上游引物LH276F22:5’-TCCAGCTCTTACCCTTCTACTT-3’,下游引物LH799R26:5’-CTCACACAATAAATCCTAATAACCC-3’;
三叶草斑潜蝇LT:
上游引物LT298F24:5’-ATAAGCAGAATAGTAGAAAACGGA-3’,下游引物LT798R26:5’-CTCATACAATAAAACCTAACAATCCA-3’;
所述各特异引物的上下游引物的Delta G值绝对值不超过9;可形成引物二聚体或发夹结构的结合碱基对不超过3个;GC%含量控制在30%-70%之间,且上下游之间不要相差太大;错误引发效率不超过100;各特异引物最适退火温度均设定为52℃。
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