[发明专利]美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及斑潜蝇的有关特异引物的鉴定方法，具体来说是美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法。

背景技术

美洲斑潜蝇L.sativae Blanchard又名蔬菜斑潜蝇、美洲甜瓜斑潜蝇、苜蓿斑潜蝇，1938年在阿根廷首次被发现，现已在我国29个省、自治区和直辖市分布，如海南、广东、福建、湖北、湖南、浙江、安徽、四川、河南、山东、北京等，对我国的瓜果蔬菜、棉花、烟草、花卉等造成了严重的危害，并逐渐成为我国农业生产过程中的一个突出问题。美洲斑潜蝇的食性为杂食性，寄主范围广，可危害葫芦科、茄科、豆科、十字花科等40余科110多种蔬菜瓜果。该虫主要以幼虫为害，成虫扩散能力不强，主要吸取植株叶片汁液，成虫产卵于植物叶片内，幼虫在叶脉间取食叶片正面叶肉组织并形成先细后宽的非常弯曲、纵横交错的蛇形潜道，潜道两侧有黑色排粪线。植株受害后会导致叶片光和作用下降或脱落，果实发育不良，造成减产。

南美斑潜蝇L.huidobrensis(Blanchard)又名拉美斑潜蝇，原产于南美洲，1993年在我国云南首次被报道，现已蔓延至云南、贵州、湖北、四川、重庆、福建、山东、北京、陕西、陕西及内蒙古等地，对我国的花卉及蔬菜危害严重。该虫食性为杂食性，可危害葫芦科、茄科、豆科、十字花科、伞形科、菊科等约40科140多种植物。该虫成虫和幼虫均可危害植株，雌虫通过在叶片刺孔形成刻点取食及产卵，雄虫不形成刻点，但可通过雌虫形成的刻点取食，造成植株光和作用下降。幼虫潜食叶肉，但与美洲斑潜蝇幼虫不同的是，南美斑潜蝇幼虫主要沿叶脉潜食，其次潜食叶脉间叶肉并形成较宽较直潜道。

三叶草斑潜蝇L.trifolii(Burgess)又名三叶斑潜蝇、非洲菊斑潜蝇，原产于北美洲。1998年首先在台湾省被发现，大陆地区于2005年12月在广东省中山市首次发现，后于2006年4月在海南省被报道，后又于2008年7月在江苏省泰兴市被报道，是我国重要的检疫性有害生物之一。三叶草斑潜蝇是典型的杂食性昆虫，寄主范围包括葫芦科、茄科、豆科、十字花科、伞形科、菊科、锦葵科等20多科300余种植物。该虫幼虫在叶片和叶柄中取食，形成弯弯曲曲的潜道，雌虫在叶片上取食形成缺刻并最终形成白色斑点，该虫对农作物的危害与美洲斑潜蝇与南美斑潜蝇类似。

这三种斑潜蝇为口岸经常截获斑潜蝇属种类，其中三叶草斑潜蝇为进境检疫性有害生物，但由于形态极其相似，给快速鉴定带来了一定的困难。因此，研究这三种斑潜蝇的特异引物，对于我们在口岸中对于截获的斑潜蝇进行快速鉴定具有重要意义。

传统鉴定斑潜蝇的研究方法包传统形态学鉴定和分子生物学方法鉴定。其中分子生物学方法包括同工酶电泳技术、限制性片段长度多态性PCR(RFLP-PCR)技术、随机扩增多态性DNA PCR(RAPD-PCR)技术和核酸序列分析鉴定技术。同工酶电泳技术对于操作人员的专业技能要求较高，要求操作人员能够准确的解读电泳酶谱；限制性片段长度多态性PCR技术可准确区分斑潜蝇近缘种，但筛选所需限制性内切酶种类的工作量较大；随机扩增多态性DNA PCR虽然操作简单，但重复性较差，对实验条件要求较高。因此，缩短种类鉴别时间，简化实验步骤成为了斑潜蝇属近缘种分子生物学方法鉴定的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、可重复性强，灵敏度高且稳定、快速的美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法。

一种美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法，其特征在于：所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法是根据美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的mtDNA COI序列分别合成各自的特异引物，以所述三种斑潜蝇基因组DNA为模板，分别同时进行使用相同模板但引物不同的三次PCR扩增获得各自的PCR反应产物，取各自的PCR反应产物，在琼脂糖凝胶、电泳缓冲液中电泳检测，经染色后，在凝胶成像系统中观察并成像，同时，对出现特异性条带的扩增产物直接进行双向测序，测序结果通过BOLD在线比对，如果在使用美洲斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且其分子量大小为250-500bp，常为410bp，确定该斑潜蝇为美洲斑潜蝇；如果在使用南美斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且其分子量大小为550-600bp，常为550bp，确定该斑潜蝇为南美斑潜蝇；如果在使用三叶草斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且其分子量大小为450-550bp，常为520bp，确定该斑潜蝇为三叶草斑潜蝇。