[发明专利]基于荧光偏振的EGFR基因启动子甲基化状态均相检测法有效
申请号: | 201210089332.2 | 申请日: | 2012-03-30 |
公开(公告)号: | CN102618645A | 公开(公告)日: | 2012-08-01 |
发明(设计)人: | 张菊;姜英浩;梁平;王萌;强少盈;颜真 | 申请(专利权)人: | 中国人民解放军第四军医大学 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64 |
代理公司: | 西安新思维专利商标事务所有限公司 61114 | 代理人: | 黄秦芳 |
地址: | 710032 陕西省西安市长乐西*** | 国省代码: | 陕西;61 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 基于 荧光 偏振 egfr 基因 启动子 甲基化 状态 均相 检测 | ||
1.一种用于测定样品中EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测法,所述均相检测法包括下列步骤:(1)从样品中得到提取物:使用一种试剂或试剂盒从待测样品中提取基因组DNA,再用另一种试剂或试剂盒处理基因组DNA并纯化,得到纯化的提取物;(2)扩增结合:将上述纯化的提取物加入反应试剂进行扩增结合,所述反应试剂包括10倍的PCR缓冲液,浓度各为 2.0~2.5mmol/L的dNTP,2.0~3.5mmol/L的MgCl,1-5U/μl的TaqDNA聚合酶,浓度为0.5-2.0μmol/L的EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化和非甲基化上游引物、下游引物,以及浓度为0.05-0.2μmol/L的靶基因的5’端带荧光标记的探针,所述反应条件是:94-95℃变性4-10min后,95℃孵育5-40秒,55-65℃孵育15-60秒,72℃孵育10-60秒,35-45个循环,最后室温15-30℃孵育;(3):检测:检测反应溶液的荧光偏振FP值,SPSS软件计算FP均值(means)和标准差(S.D.),t检验统计阴性、阳性对照反应终液FP值分布,阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)-阴性对照FP标准差(S.D.),阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)+阴性空白对照FP标准差(S.D.),待测样品FP值与Cut-off值比较即知靶区域CpG位点甲基化状态:待测样品FP值>阴性临界值 Cut-off值,靶区域CpG位点为非甲基化状态,待测样品FP值<阳性临界值Cut-off值,靶区域CpG位点为甲基化状态,阳性临界值Cut-off值<待测样品FP值<阴性临界值Cut-off,则靶区域CpG位点甲基化状态无法判断,需重新检测。
2.权利要求1 的检测法,其中步骤(1)包括:在试剂或试剂盒中进行处理获取基因组DNA;以及将所述基因组DNA在试剂或试剂盒中进行处理,通过化学反应,使未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,发生了甲基化的胞嘧啶保持不变,将有无甲基化修饰的差异转变为核苷酸序列的差异;其中所述获取基因组DNA的试剂或试剂盒为内含蛋白酶K、细胞裂解液的DNA提取液,及内含酚/氯仿、乙醇或DNA纯化用DEAE树脂或DNA吸附柱的试剂;其中所述处理基因组DNA的试剂或试剂盒为内含过硫酸氢钠(NaHSO3)的试剂或试剂盒,回收的DNA通过PCR来扩增,在PCR扩增过程中,5′位置上甲基化的胞嘧啶保持完整。
3.权利要求1或2的检测法,其中所述引物为EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化和非甲基化通用的上游引物、下游引物,所述5’端带荧光标记的探针为EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化同源的探针,能够与所获得的扩增子结合以产生能够检测的荧光偏振值变化;荧光偏振仪检测所述各反应终液以获得荧光偏振测量值;以及将荧光偏振测量值与特征性荧光偏振数值相比较,所述特征性荧光偏振数值为阴性对照反应终液FP均值、Cut-off值。
4.权利要求1或2的检测法,根据待测EGFR基因的启动子DNA序列,避开CG位点设计通用引物,其中所述覆盖EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化和非甲基化通用上游引物、下游引物序列为:正向引物5'-ggttttttgattttgtttagtattg-3',反向引物5'-ccttacctttcttttcctcc-3',探针序列为5'-ttgggagagtcggagcgagttt-3',或5'-ttcggggagtagcgatgcgatt-3',或5'-agtcggagcg agtttttcggg-3',或5'-gagtagcgatgcgatt-3',或5'-tttcgggacggtcggggt-3',或5'-agcgtttttggcgttgt-3',或 5'-ttgcgttttgttcggcgagtcgggt-3'。
5.权利要求1或2 的检测法,其中所述末端标记的荧光素为TAMRA(四甲基罗丹明),或FAM(羧基荧光素)、R110(罗丹明)、FITC(异硫氰酸荧光素)、TET(四氯荧光素)、HEX(六氯荧光素)、ROX 、BTR。
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