[发明专利]基于荧光偏振的EGFR基因启动子甲基化状态均相检测法

说明书

技术领域：

  本发明涉及EGFR基因启动子甲基化状态的检测领域。尤其涉及一种均相检测法，其通过改变荧光偏振值以监测样品中存在的EGFR基因启动子甲基化状态。

背景技术：

表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR) 基因位于7号染色体p13～q22区，全长约200kb，是HER／ERB-B跨膜受体激酶家族成员之一，由胞外段、跨膜区和胞内激酶活性区构成。EGFR胞外段的主要功能是结合表皮生长因子(EGF)等配体，激活胞内段酪氨酸激酶活性，启动信号传导通路，在组织中起到调节细胞增殖、分化的作用。EGFR基因5′调控区包括1个富含GC岛的启动子，CpG岛的异常高甲基化并没有改变基因序列，却可以调控基因的表达，导致转录失活，使该基因表达沉默。EGFR的表达受其启动子DNA甲基化调控，EGFR的转录沉默与CpG岛高甲基化相关。部分实体瘤患者EGFR低表达或不表达,EGFR转录沉默且CpG岛呈现高甲基化，EGFR靶向药疗效差。EGFR基因异常甲基化是多种癌肿发生的一个早期事件，可以作为多种癌肿早期诊断的分子标志物和预防的检测。并且，DNA甲基化是可以逆转的过程，抑制DNA甲基化，使已发生甲基化的基因去甲基化，激活沉默失活的基因，可作为肿瘤治疗的新途径。因此，EGFR基因启动子甲基化检测不仅广泛用于表观遗传学研究，也能预警肿瘤发生、预测疗效，为肿瘤早期诊断、预后判定及指导预见性个体化用药提供依据。而且DNA甲基化不仅存在于组织中，在外周血、积液和痰液中均可检出，这一优点对相关的表观遗传学研究及开展早期、敏感无创的诊断意义重大。

目前，国外对EGFR基因启动子甲基化状态的测定分析方法已有一些报道，如Bisulfite Sequencing PCR (BSP)、 MSP(methylation Specific PCR)、COBRA assay、DHPLC、Methylight、微阵列、焦测序技术等技术方法，这些检测方法需要多种反应步骤、、操作复杂，检测多需洗脱纯化待检分子和电泳检测，多步后处理费时费力、成本高，仪器设备昂贵，不能做到既简单快速完成反应又简单客观检测分析，效率有待提高，因而难于推广应用。

因此，需要获得一种操作简便、特异准确、易标准化和自动化、低成本的基因甲基化液相检测新方法。

本发明的实施方案提供了一种测定样品中EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测法，该方法以荧光偏振的测量为基础。荧光偏振技术的原理如下：具有较低分子量的荧光探针由于其快速旋转而具有较小偏振度，而具有较大分子量的荧光探针由于其慢速旋转而具有较大偏振度。因此，当与较大分子结合时，荧光团的偏振度增大，荧光偏振数值增加。

发明内容：

本发明涉及一种用于测定样品中EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测法，所述均相检测法包括下列步骤：（1）从样品中得到提取物：使用一种试剂或试剂盒从待测样品中提取基因组DNA，再用另一种试剂或试剂盒处理基因组DNA并纯化，得到纯化的提取物；（2）扩增结合：将上述纯化的提取物加入反应试剂进行扩增结合，所述反应试剂包括10倍的PCR缓冲液,浓度各为 2.0～2.5mmol/L的dNTP，2.0～3.5mmol/L的MgCl2，1-5U/μl的TaqDNA聚合酶，浓度为0.5-2.0μmol/L的EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化和非甲基化上游引物、下游引物，以及浓度为0.05-0.2μmol/L的靶基因的5’端带荧光标记的探针，所述反应条件是：94-95℃变性4-10min后，95℃孵育5-40秒，55-65℃孵育15-60秒，72℃孵育10-60秒，35-45个循环，最后室温15-30℃孵育；（3）：检测：检测反应溶液的荧光偏振FP值，SPSS软件计算FP均值(means)和标准差(S.D.)，t检验统计阴性、阳性对照反应终液FP值分布，阳性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)-阴性对照FP标准差(S.D.)，阴性临界值Cut-off=阴性对照FP均值(means)+阴性空白对照FP标准差(S.D.)，待测样品FP值与Cut-off值比较即知靶区域CpG位点甲基化状态： 

待测样品FP值>阴性临界值 Cut-off值，靶区域CpG位点为非甲基化状态,

待测样品FP值＜阳性临界值Cut-off值，靶区域CpG位点为甲基化状态,

阳性临界值Cut-off值＜待测样品FP值＜阴性临界值Cut-off，则靶区域CpG位点甲基化状态无法判断，需重新检测。