[发明专利]甘蓝型油菜BnCP51启动子及制备方法和应用

权利要求书

1.一种分离的启动子P_BnCP51，其序列为SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述的启动子的重组载体pBI-P_BnCP51。

3.权利要求1所述的一种甘蓝型油菜启动子P_BnCP51的制备方法，其步骤是： 

（1）油菜启动子P_BnCP51的引物序列:

根据油菜全基因组测序获得的BnCP51基因上游2kb序列设计1对引物进行PCR扩增，扩增获得油菜BnCP51的5’上游启动子序列，所用引物为PBnCP51S：5 ′-(Kpn I)CGGGGTACCGGTAAAATCTCTTGTAGCCCGT-3'和PBnCP51A：5′- (Xba I) GACATCTAGATTTTTTGTTTGTTTTGGGGAA-3 ′；

（2）油菜启动子P_BnCP51的制备:

根据油菜全基因组测序获得的BnCP51的5’上游2kb序列设计所用的引物：PBnCP51S：5 ′-(Kpn I)CGGGGTACCGGTAAAATCTCTTGTAGCCCGT-3'和PBnCP51A：5′- (Xba I) GACATCTAGATTTTTTGTTTGTTTTGGGGAA-3，利用SDS裂解法提取油菜叶片基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，步骤是：提取油菜基因组DNA 25μl，以此为模板进行扩增，反应体系为50 μl，分别添加10×Ex Taq buffer 5 μl，dNTP 4 μl，5’引物 1 μl，3’引物 1 μl，ExTaq  0.5 μl，DNA模版1 μl约100ng，ddH₂O 37.5μl， 扩增产物大小为1960 bp，PCR反应程序为94℃ 5 分钟，94℃1 分钟，59℃ 1分钟，72℃ 2分钟，33个循环，72℃ 10分钟，16℃ 3小时，PCR产物经1.0%质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒纯化回收后，连接到pMD18-T载体，热激法转化gold菌株的感受态细胞，挑取阳性克隆，PCR检测阳性和酶切验证后测序，得到目的基因上游2kb侧翼序列，经过生物信息学分析此序列为BnCP51的启动子全长序列，命名为P_BnCP51。

4.权利要求1中所述的一种分离的启动子P_BnCP51在拟南芥花药中的应用。

5.权利要求1中所述的一种分离的启动子P_BnCP51在拟南芥花粉粒中的应用。