[发明专利]一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是体外酶促合成扩增DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得到扩增。PCR技术出现之后，根据不同的需要被不断改进，广泛应用于基因分离、克隆和核酸序列检测等领域。

现有技术提供了一种基于固相载体进行扩增的方法，其实现步骤包括：(1)将待测样品与带有亲水性正离子的固相载体混合，使得待测样品中含有的一种或多种靶标核酸以单链核酸片段的形式结合到固相载体上；(2)将引物与带有靶标核酸的固相载体混合，使引物与靶标核酸杂交结合，得到带有引物-靶标核酸的固相载体；(3)利用带有引物-靶标核酸的固相载体进行PCR扩增，得到扩增产物。该技术利用固相载体进行扩增，采用引物直接与固相载体上固定的靶标核酸杂交结合，因此扩增反应之后，扩增产物游离于液相中，未结合于固相载体表面，因此固相载体表面结合的扩增产物量少。

利用该现有技术进行扩增，需以大量核酸分子为模板，当固相载体表面的模板较少时无法保证扩增的顺利进行，因此降低了固相载体的利用率，提高了成本；若以扩增反应结束后的固相载体进行测序，很容易出现由于固相载体表面带有的靶标核酸过少，检测信号过弱而无法准确读取靶标核酸序列的现象，因此该现有技术对检测仪器要求高，测序的准确性存在局限性。

因此需要一种新的基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法，能够提高固相载体表面的扩增产物结合量，确保扩增的顺利进行，从而提高固相载体的利用率，降低成本，进而增强核酸测序的检测信号，降低对检测仪器的要求，在同等检测条件下可以提高测序的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法，能够提高固相载体表面的扩增产物结合量，确保扩增的顺利进行，从而提高固相载体的利用率，降低成本，进而增强核酸测序的检测信号，降低对检测仪器的要求，在同等检测条件下提高测序的准确性。

为实现本发明的目的之一，一种基于固相载体进行扩增的方法，所述固相载体表面固定有至少一个模板序列，所述方法包括以下步骤：

A.将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点，得到固定有引物的扩增载体；

B.对扩增载体上的模板序列进行扩增，得到扩增产物。

其中，步骤A所述引物包括用于对所述模板序列进行扩增的上游引物和/或下游引物，所述上游引物是与模板序列5’端互补结合的核酸序列，所述下游引物是与模板序列3’端序列相同的核酸序列。

其中，步骤B中所述的扩增方式是单分子扩增。

进一步的，所述单分子扩增方式包括乳液PCR扩增、滚环扩增和桥式PCR扩增的任一种。

其中，所述引物结合于固相载体表面的方式为：

引物与固相载体表面携带的基团进行配对连接，实现直接结合；

或通过连接子携带的基团分别与引物和固相载体表面携带的基团进行配对连接，实现间接结合。

进一步的，所述配对连接的方式采用生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、丙烯酰胺-硅烷基/聚丙烯酰胺中的至少一种。

其中，所述固相载体的材质采用玻璃、硅胶、陶瓷、塑料和金属中的至少一种。

其中，在步骤A之前还可以包括步骤：

A0.将模板序列通过基团配对方式结合于固相载体表面，得到固定有至少一个模板序列的固相载体。

进一步的，所述引物及模板序列与固相载体采用不同的基团配对进行结合，所述固相载体表面或连接子带有至少两种基团。

其中，步骤B之后还可以包括步骤：

B’.对扩增产物进行纯化回收。

为实现本发明的目的之二，一种基于固相载体进行核酸测序的方法，所述固相载体固定有至少一个模板序列，所述核酸测序的方法包括以下步骤：

A.将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点，得到固定有引物的扩增载体；

B.对扩增载体上的模板序列进行扩增，得到扩增产物；

C.根据碱基互补原则对扩增产物进行核酸测序，得核酸序列信息。

其中，步骤A中所述引物包括肿瘤类易感基因引物、心血管疾病类易感基因引物、营养指导基因引物和单基因疾病检测引物中的任一种。

其中，所述步骤C包括以下步骤：