[发明专利]焦磷酸测序法检测他莫昔芬个体化用药基因多态性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测他莫昔芬个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

他莫西芬是一种非固醇类抗雌激素药物，目前广泛用于雌激素受体阳性的乳腺癌患者的预防和治疗。在体内他莫西芬的代谢有多种药物代谢酶参与，大约10％他莫西芬由CYP2D6代谢成活性代谢产物4-羟基-N-去甲基他莫西芬(endoxifen)。在中国人群中，CYP2D6最常见的功能减弱等位基因突变型为CYP2D6*10(约占53％)。在一项200名乳腺癌患者接受TAM作为辅剂的疗法中，CYP2D6慢代谢者无瘤生存率较低，这与活性代谢产物endoxifen生成减慢从而导致疗效的下降相一致。在另一项293名接受治疗的乳腺癌患者中，携带CYP2D6*10等位基因的T/T型患者与C/T型或C/C型患者相比，血中4-羟-他莫西芬(另一活性代谢产物)较低，且临床结果较差。接受他莫昔芬治疗的乳腺癌患者的CYP2D6基因型与血液中活性代谢产物的浓度密切相关，并因此显著影响患者的复发率和生存期。因此美国FDA已于2006年建议患者在接受他莫昔芬治疗前首先对CYP2D6的基因型进行检测。

他莫昔芬经CYP2D6代谢为活性代谢产物4-OH-他莫昔芬后结合雌激素受体的能力大大增强，该4-OH-代谢产物由SULT1A1硫酸盐化作用代谢失活，因此SULT1A1基因多态性或者活性对于他莫昔芬的疗效具有重要影响。His213(SULT1A1*2)造成酶活性降低2倍且蛋白稳定性降低，造成4-OH-代谢产物难以代谢为活性硫酸盐-他莫昔芬，据推测该次级代谢产物的药理活性更高。因此，如果该产物不能形成，化疗效果及存活率将大大降低。

综上所述，CYP2D6*10(rs1065852)和SULT1A1*2(rs9282861)基因多态性是影响他莫昔芬需求剂量差异性的主要因素，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CYP2D6*10和SULT1A1*2基因多态性的试剂盒将为他莫昔芬的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

CYP2D6*10(rs1065852)和SULT1A1*2(rs9282861)基因多态性是影响他莫昔芬剂量个体差异的最主要因素。本发明提供一种检测影响临床他莫昔芬个体化用药治疗的用药基因CYP2D6(SEQ ID NO.1)和SULT1A1(SEQ ID NO.2)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测他莫昔芬个体化用药相关基因SNP。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种焦磷酸测序法检测他莫昔芬个体化用药基因多态性的试剂盒，包括如下引物：

(1)扩增引物：

CYP2D6*10(rs1065852)上游引物：5′-GTA GTG AGG CAG GTA TGGG-3′(SEQ ID NO.3)；

SULT1A1*2(rs9282861)上游引物：5′-GGA GAT TCA AAA GAT CCTGGA-3′(SEQ IDNO.4)；

CYP2D6*10(rs1065852)下游引物：5′-CAG GAC CTC CTC CCT CAC CTGGTC-3′(SEQ IDNO.5)；

SULT1A1*2(rs9282861)下游引物：5′-TTC ATC TCC TTG AAC GAC G-3′(SEQ IDNO.6)；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

(2)测序引物：

CYP2D6*10(rs1065852)测序引物：5′-GCA GGG GGC CTG GTG-3′(SEQIDNO.7)；

SULT1A1*2(rs9282861)测序引物：5′-TGG AGT TTG TGG GGC-3′(SEQ ID NO.8)；

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

一种应用权利要求1所述的试剂盒检测他莫昔芬用药基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)DNA提取；

(2)聚合酶链反应：