[发明专利]一种重组黑麦草花粉过敏原与突变体的制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组黑麦草花粉过敏原，其特征在于在重组黑麦草过敏原的基础上衍生的非天然存在的突变体，其中B细胞或/和T细胞表位的至少一个表面暴露的保守氨基酸残基被在天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的另一残基取代，该突变体具有与天然出现的过敏原基本相同的α-碳骨架三级结构。

2.权利要求1所述的一种黑麦草花粉过敏原的突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1所述一种重组黑麦草花粉过敏原的制备方法，其特征在于包括如下步骤：编码权利要求1所述重组黑麦草花粉过敏原的基因依据相应的表达宿主的情况通过密码子优化得到，并以之获得重组载体后，转化大肠杆菌、酵母或植物，得到重组宿主，蛋白表达后得到权利要求1所述的重组黑麦草花粉过敏原。

4.根据权利要求3中所述的一种重组黑麦草花粉过敏原的制备方法，其特征在于所述表达宿主是大肠杆菌表达系统，名称为Escherichia coli JM109-Q4DF，并已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 2011177，保藏日期为2011年5月19日，保藏地点为中国.武汉.武汉大学；该宿主表达与纯化后可以获得权利要求1所述的重组黑麦草花粉过敏原。

5.根据权利要求3所述的一种重组黑麦草花粉过敏原的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1) 从数据库中获取此蛋白的核酸序列，根据表达宿主的密码子偏好性对其进行密码子优化，优化后序列中GC含量为35~65%，原氨基酸序列不变；

(2) 人工合成优化后的核酸序列；

(3) 经双酶切后，与表达载体连接，构建成重组载体；

(4) 将重组载体转化表达宿主中，选择阳性转化物；

(5) 在20-38℃下，培养阳性转化物，用浓度为0.01~2.0 mmol/L的诱导剂来诱导重组蛋白表达，诱导温度为4-38℃；

(6) 所得培养物通过超声波破碎或其它裂解方法裂解宿主细胞后，通过超滤法、层析法、离心法、等电点沉淀法等纯化方法获得高纯度的重组蛋白。

6.权利要求2所述的一种重组黑麦草花粉过敏原的突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（a）采用生物信息学软件预测权利要求1所述重组黑麦草花粉过敏原的氨基酸序列的优势抗原表位；

（b）采用定点法改变抗原性高的位点，用天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的氨基酸残基取代原有的氨基酸残基；

（c）获得黑麦草花粉过敏原突变体的基因片段，经酶切后，与表达载体连接，构建成突变型重组载体；

（d）按照权利要求5所述步骤（4）~（6）的方法，获得高纯度的重组突变蛋白。

7.权利要求1-6所述的重组黑麦草花粉过敏原或其突变体在制备药物中的应用，该药物用于治疗变态反应性疾病并使对黑麦草花粉过敏原乃至其它类型过敏的患者产生免疫耐受；或者用来诊断变态反应性疾病或者判断其它食品药品的过敏原性的高低。

8.权利要求7中所述的药物或诊断试剂，其特征在于它包含根据权利要求1~6中任意一项的重组过敏原，任选与药用或者诊断试剂中可接受的赋形剂和/或载体，并且任选佐剂和/或偶联剂组合。