[发明专利]一种重组黑麦草花粉过敏原与突变体的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组黑麦草花粉过敏原与突变体的制备方法和应用。 

背景技术

近几十年来，随着工业化，城市化进程的推进，变态反应疾病的发病率呈逐渐上升趋势。在发达国家，近15% - 30%的人对花粉过敏，在我国，对花粉过敏的病人至少有500-1000万，且近年来花粉过敏患者的发病率有持续上升的趋势。所以植物花粉过敏原的分子生物学研究是世界变态反应学界研究的热点之一。花粉过敏症既与人自身的体质有关也与空气中花粉的种类和浓度有关。空气中花粉的数量主要受地域环境，季节，气候和植物自身的生活影响。我国地域辽阔，植物种类繁多，致敏花粉也呈现出多样性。加之城市绿化的普及，人们接触花粉的机会增加，使得花粉过敏症的发病率有增长的趋势。花粉变应原可导致人体产生变应性鼻炎、皮炎、支气管哮喘等过敏性疾病。因此，对花粉变应原的深入研究有利于了解疾病发生的原因，为开展特异性免疫诊疗奠定基础。 

植物花粉是主要的吸入性变应原，能诱导人体产生I型超敏反应。目前国内外对花粉过敏治疗所采用的策略多种多样，其中较为有效的是采取变应原特异性免疫治疗，简称免疫治疗(special immune treatment，SIT)。这种方法被认为是目前唯一的过敏疾病医学治疗方法，它可缩短病程、阻滞症状的恶化和防治对新的过敏原产生过敏。但也暴露出一些新问题：由于临床上所采用的变应原来源于花粉的粗提液，成分非常复杂，既包含主要、次要变应原以及其它一些非变应原蛋白。这就势必增加引起新的过敏反应的可能性。近年来，基因工程的发展为生产高纯度的变应原提供了值得考虑的思路和方法，基重组变应原替代天然变应原提取液在临床上取得良好的效果。相比较而言，利用基因工程技术，通过定点突变的方法获得低过敏原性或无过敏原性的重组黑麦草花粉过敏原的突变体，在一定程度上可从源头上降低治疗过程中的风险，同时能够保留黑麦草花粉过敏原的生物学活性。另外，重组过敏原的生产条件稳定，且标准化程序简单，有利于广泛应用于临床的诊断和治疗。因此，重组弱化过敏原将是一种很好的替代方法，有广阔的发展前景。 

全世界大约有4亿人对草花粉过敏，草过敏原分为Group Ⅰ、Group Ⅱ、 Group Ⅲ、Group Ⅳ及Group Ⅴ。其中GroupⅤ是最重要的草花粉过敏原，在对草过敏的病人中，有80%的人对GroupⅤ过敏。黑麦草是禾本科黑麦草属的植物之一，花果期5-7月。Lol p 5是黑麦草5种花粉过敏原之一，同时也是GroupⅤ草过敏原的代表蛋白。黑麦草的种植不仅能够提供大量优质牧草，同时在改善稻田土壤生态环境、减少水土流失、减轻农业环境污染方面具有重要作用。但是黑麦草的广泛种植，使得黑麦草花粉在空气中所占比例不断上升，受到了广大研究者的重视。 

发明内容

本发明的目的在于针对上述存在的问题及天然黑麦草花粉过敏原纯度的不足，在克隆表达重组黑麦草花粉过敏原的基础上，利用生物信息学软件分析黑麦草花粉过敏原的抗原表位，突变一个或多个抗原性高的位点，从而获得低过敏原性的黑麦草花粉过敏原突变体，期望能够安全高效地应用于过敏性疾病的治疗。 

本发明的另一个目的是提供一种编码上述黑麦草过敏原及其突变体的基因。 

本发明的另一个目的是提供含有上述基因的重组质粒载体。 

本发明的另一个目的是提供上述基因转化的重组表达宿主。 

本发明的另一个目的是提供一种上述重组黑麦草花粉过敏原及其突变体的制备方法。 

本发明的另一个目的是提供一种重组黑麦草花粉过敏原用作药物或者诊断试剂的制备方法。 

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

本发明的重组黑麦草花粉过敏原，是天然存在的黑麦草花粉过敏原衍生的非天然存在的变异体，其核酸序列经密码子优化后，人工合成全长的重组黑麦草花粉过敏原基因。采用生物信息学软件分析其抗原表位，针对一个或多个抗原性指数高的位点进行有目的的置换，获得重组黑麦草花粉过敏原突变体的基因，使其在保持原有生物学活性和空间结构的基础上，能够有效地降低重组黑麦草花粉过敏原的过敏原性。然后利用大肠杆菌表达系统，在人工控制的条件下，获得高纯度的重组黑麦草花粉过敏原及其突变体蛋白。与天然黑麦草花粉过敏原相比，该重组蛋白突变体与特异性IgE的结合性能明显减少，可安全地应用于过敏性基本的预防和治疗。

一种重组黑麦草花粉过敏原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。