[发明专利]一种真菌发酵产物的制备方法及在水稻病害防治中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种真菌发酵产物的制备方法，可用于水稻病害的防治，属于生物防治领域。

背景技术

大型真菌不但种类繁多，而且是“创造系数”很高的生物类群。大型真菌中发现的天然产物结构多样，并且具有抗细菌、促进神经生长因子合成、酶抑制剂、抗真菌、细胞毒、受体拮抗剂和抗氧化等多种生物活性。

担子菌与人类的关系极为密切。在发现了一些种对抗肿瘤和预防冠心病方面有作用之后，受到了医药界的重视并引起极大的兴趣。担子菌产生的生理活性物质有多糖类、多肽和蛋白质、抗生素类、维生素类等，其中抗生素类包含聚乙炔类化合物，如田头菇素（Agrocybin），HOCH2·(C≡C)3·CONH2，来源于Agrocybe cylindracea，对革兰氏阳性菌、阴性菌及真菌有拮抗作用。

微生物源农药包括农用抗生素和活体微生物两大类。其中农用抗生素是由抗生菌发酵所产生的具有农药功能的次生代谢物质，它是有明确分子结构的化学物质。农用抗生素无疑是农药中的一个重要组成。由于其源于生物，故越来越受到人们关注。目前，在害虫的生物防治方面，真菌是研究、生产和应用最多的生物类群之前。真菌类生物农药主要是生真菌，目前在世界上记载的约有100属，800多种，大部分是兼性或专性病原体。真菌杀虫剂的研究在我国有较长历史，对制剂的安全性、防治松毛虫和玉米螟等研究都做了大量工作，但工业化生产技术至今未解决，因而始终没有正式商品问世。

开发具有防治水稻稻瘟病、纹枯病和细菌性条斑病等重大病害的绿色农药，对保护稻田湿地功能和减少稻田由于化学农药使用造成的面源污染具有重要意义，也可促进生态农业和绿色农业的发展。基于以上背景，开展本发明的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种真菌发酵产物的制备方法及在水稻病害防治中的应用。

本发明首先提供了一种真菌发酵产物的制备方法，所述制备方法包括：

1)液体培养及发酵产物处理：将真菌Agrocybe sp.YB2005活化后进行液体深层发酵，液体深层发酵的培养基配方按重量比为：马铃薯16-25%，葡萄糖1.5-2.5%，蛋白胨0.3-0.7%，余量为水，pH自然，0.1Mpa、121℃灭菌30min，置于25－28℃，180－230r/min恒温摇床中培养7-12天；发酵结束后，用离心法将菌丝体与发酵液分离，发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏；

2)产物分离：将1)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，经凝胶柱层析，甲醇为洗脱剂，洗脱液用TLC-生物自显影法测定抗菌活性物质，合并具有活性的组分，将活性组分用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用不同梯度甲醇-水洗脱，洗脱液用TLC-生物自显影法活性追踪，收集活性组分，接着上硅胶柱，用石油醚-丙酮梯度洗脱，TLC-生物自显影法收集活性组分得到具有抗菌活性的产物即为真菌发酵产物；

所述于真菌Agrocybe sp.YB2005已于2012年3月12日保藏于中国典型培养物保藏中心

，保藏编号CCTCC NO：2012076。

所述液体深层发酵的培养基配方按重量比为：马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，余量为水。

所述TLC-生物自显影法中，TLC采用氯仿：甲醇体积比为为10：1的展开剂；具体操作为：点样后在展开剂中展开，然后将薄层板反盖在混有水稻细条病病原菌的培养平板上，20分钟后，移走薄层板，将培养平板置于28℃培养，3天后观察抑菌情况。

步骤2）中所述用不同梯度甲醇-水洗脱，其中甲醇所占体积比分别为：10%、20%、30%、40%、50%。

步骤2）中所述硅胶柱采用石油醚-丙酮体积比分别为7:1、6:1、5:1的梯度洗脱。

本发明还提供了所述的真菌发酵产物在水稻病害防治中的应用。

其中所述水稻病害为水稻稻瘟病、水稻纹枯病或水稻细条病。

本发明制备的真菌发酵产物对水稻细条病、水稻纹枯病和水稻稻瘟病有较好的防治效果，可以利用本发明所述的菌株Agrocybe sp.YB2005发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实现工业化生产。

附图说明

图1 化合物8-hydroxy-2,4,6-octatriynamide的单晶X-Ray衍射图。

图2 化合物8-hydroxy-2,4,6-octatriynamide的¹H-NMR图。