[发明专利]一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法

权利要求书

1.一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA103，其保藏编号为CCTCC NO：M 2012032。

2.权利要求1所述的产丁二酸基因工程菌菌株大肠埃希氏菌 BA103的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株，利用同源重组技术敲除ptsG基因后，再过量表达丙酮酸羧化酶，得到能够利用葡萄糖产丁二酸的大肠埃希氏菌 BA103。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1） 以缺乏ldhA基因，pflB基因活性的菌株为出发菌株，敲除其中的葡萄糖专性转运系统中的ptsG基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和ptsG的感受态菌株；

（2）合成一对5’端带有酶切位点的引物，纯化扩增出的pyc基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pyc； 

（3）将步骤（2）所述的重组质粒pTrc99a-pyc导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；

（4）利用步骤（3）的阳性转化子表达丙酮酸羧化酶，得到可利用葡萄糖代谢产丁二酸基因工程菌大肠埃希氏菌BA103。

4.利用权利要求1所述的大肠埃希氏菌BA103发酵生产丁二酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于具体步骤是：将大肠埃希氏菌 BA103按体积比1%接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体OD₆₀₀至0.4～0.6用0.5 mM的IPTG诱导至OD₆₀₀=3时，按3倍菌泥接种量转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。