[发明专利]一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法

说明书

技术领域

    本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法，具体是一株高效利用葡萄糖生长并产丁二酸重组菌株及其利用该菌株发酵生产丁二酸的方法。

背景技术

丁二酸(又称琥珀酸)作为一种C4平台化合物，不仅被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，还可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。目前工业应用的丁二酸主要采用化学方法生产，污染大、成本高，制约了丁二酸作为大宗化学品的发展潜力。利用微生物发酵法转化可再生资源生产琥珀酸、价格低廉、污染小，且在发酵过程中可吸收固定CO₂，开辟了温室气体利用的新途径， 工艺过程具有绿色、 能耗低、 原子经济性高的优点，近年来成为研究的热点。

丁二的生产菌株很多，目前主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens和重组E. coli上。利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。大肠杆菌由于对营养条件需求简单，并具有生长迅速、遗传背景清楚、易调控、易改造等特点， 因此利用基因工程手段改造大肠杆菌生产丁二酸备受关注。

现有的产丁二酸大肠杆菌基因改造策略主要有增强代谢途径中的关键酶(如PPC、PCK)、失活或敲除竞争途径中的酶(如LDH、PFL)、引入新的代谢途径(如乙醛酸循环)等。其中，E. coli NZN111由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶，丙酮酸的代谢支路大大减少，丙酮酸大量积累，最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。其自发突变株E. coli AFP111由于突变了葡萄糖专性转运系统中的ptsG基因，菌株使用葡萄糖激酶系统进行葡萄糖的转运，使丙酮酸的积累不再是糖转运的限制因素，恢复了菌株在厌氧条件下利用葡萄糖的能力，且产物主要为丁二酸，在有氧厌氧两阶段发酵培养AFP111过程中，丁二酸质量收率达到96%，生产强度为1.21 g·L^-1·h^-1。因此，在高产丁二酸大肠杆菌菌株构建过程中，减少丙酮酸的积累是重组大肠杆菌高产丁二酸的关键因素之一。

Stols等通过测定的苹果酸酶对苹果酸的K_m值，认为苹果酸酶在特定的菌种中有可能催化从丙酮酸到苹果酸的逆向反应，原因是该反应方向在热力学上是有利的。在E.coli双突变株NZN111中超量表达Ascaris suum中的苹果酸酶基因sfcA后，使苹果酸酶逆向催化生成苹果酸，减少了丙酮酸的大量积累，并以琥珀酸作为最终还原产物而大量积累。同时，Wang等人构建了E.coli NZN111/pTrc99a-mdh菌株，过量表达苹果酸脱氢酶基因（mdh）后，能使E.coli NZN111在厌氧条件下利用葡萄糖，丁二酸产量增加了5倍多，并且大大降低了丙酮酸的积累。Hui Wu和Zhi-min Li等人利用NZN111进行两阶段发酵，结果发现MDH和ICL的酶活大大提高，使丙酮酸的量大大减少，流向乙醛酸循环，从而使丁二酸的产量大幅度提高。Vemuri等人将R.etli中的pyc基因引入NZN111中，结果丙酮酸减少了3倍，丁二酸产量增加了52%。岳方方等人在JM1307中过量表达枯草芽孢杆菌中的pyc基因，结果丁二酸的产量增加了1.9倍，同时丙酮酸的量也有所减少。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种能高效利用葡萄糖生长并产丁二酸的基因工程菌株及其构建方法，并利用该菌株厌氧发酵生产丁二酸，达到菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低生产成本，提高经济效益。

为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案。

一、本发明提供的一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA103，其保藏号登记号为CCTCC NO：M 2012032。