[发明专利]牦牛源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程的技术领域，具体的说，是牦牛源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法。

背景技术

牦牛是一种能在高原高寒的恶劣环境下生存的哺乳动物，也是牛科动物唯一有纺织利用价值的成员。牦牛分为野牦牛和家牦牛，野牦牛又叫野牛，学名Bos mutus(Poěphagrt mutrs)，英文名wild yak，藏名音译亚归。牦牛生长在海拔3000米～5000米的高寒地区，能耐零下30℃～40℃的严寒，牦牛厚厚长长的毛层下聚集着细密的绒毛，这些绒毛为牦牛在高寒的天气状况下生存提供了可能。全世界现有牦牛1400多万头，大都分布在中国青藏高原及其周围海拔3000m以上的高寒地区。我国是世界上牦牛数目最多的国家，约占全世界总数的90％。

牦牛绒与紫山羊绒在外表形态上很相似，如图1所示，图1为显微镜下的紫山羊绒(左)和牦牛绒(右)的照片。两者都在显微镜下均存在色素团，给鉴别工作带来了困难。由于本身带有色素，紫山羊和牦牛绒通常会被制成深色的织物，这就进一步给检测鉴别工作增加了难度。一些不法分子利用这一相似性，将牦牛绒充作紫山羊绒坑害给消费者，从中牟利。

我国现行的标准GB/T 16988-1997《特种动物纤维与绵羊毛混合物含量的测定》对牦牛绒的描述：牦牛绒纤维鳞片张角较小，鳞片密度为100-130个/mm，毛色为黑色、棕褐色。而在一般的光学显微镜下，鳞片并不是很清晰，检测起来费时费力。电镜法成本高，且制样比较烦索。

发明内容

本发明是一种基于DNA检测技术的牦牛绒纤维的定性鉴别方法，克服了现有光学显微镜检下鳞片不清晰、费时费力缺点和；以及克服了电镜检成本高，且制样繁琐的不足。

本发明的目的在于，提供一种牦牛源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法。

本发明的另一目的在于，提供一种牦牛源性纤维成分的检测试剂盒，以及试剂盒的用途。

本发明的再一目的在于，提供一种牦牛源性纤维成分荧光定量PCR的引物和探针。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

作为本发明的第一方面，一种牦牛源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法，包括以下步骤：

步骤一、以牦牛绒的DNA为模板，进行PCR扩增；

步骤二、检测扩增产物的荧光信号；

其特征在于，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增牦牛源性纤维成分特异性引物对和牦牛源性纤维成分特异性探针。

其中，所述扩增牦牛源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

其中，所述牦牛源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

其中，所述方法还包括步骤：在聚合酶链式反应过程中或之后，检测牦牛源性纤维成分特异性探针发出的荧光信号。

其中，所述PCR扩增的条件如下：

反应体系：ABI Taqman universal PCR master mix(2×)10μl，DNA模板4μl，引物0.6μl，探针2.5μl，ddH₂O 4.9μl；

反应条件：95℃，5min；95℃，15s，60℃，45s，40个循环。

引物的浓度为0.3μM，探针的浓度为0.25μM。

作为本发明的第二方面，一种牦牛源性纤维成分的检测试剂盒，含有以下试剂：

(a)扩增牦牛源性纤维成分特异性引物对；

(b)牦牛源性纤维成分特异性探针。

进一步，所述试剂盒还包括：

(c)标准参照物。

其中，所述标准参照物是牦牛源性纤维成分DNA，或含有牦牛源性纤维成分扩增目的片段的质粒DNA，或牦牛绒。

其中，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

其中，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

其中，所述牦牛源性纤维成分特异性探针发出的荧光信号。

作为本发明的第三方面，一种牦牛源性纤维成分的检测试剂盒的应用，用于检测在纺织品中是否存在牦牛源性纤维成分。

作为本发明的第四方面，一种如权利要求1所述的牦牛源性纤维成分荧光定量PCR的特异性引物和特异性探针，其特征在于：

所述特异性引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

所述特异性探针的序列如SEQ ID NO：3所示。