[发明专利]微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸及其提纯方法

权利要求书

1.一种高产多聚N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌，其特征在于，保藏号为CGMCC No.5585。

2.一种使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在种子罐的基础培养基中接种大肠杆菌，发酵培养获得种子培养液；

2)将种子培养液接种于含上述基础培养基的发酵罐中，37℃温度下进行发酵培养，并流加碳源，控制溶氧为20％，控制pH＝7；

3)发酵后期，降低转速为75rpm/min，不控制溶氧，通气比例0.2，至发酵结束。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌的保藏号为CGMCC No.5585。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的基础培养基的碳源为葡萄糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖含量为10～35g/L。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中流加的碳源为葡萄糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中流加葡萄糖的方法为：在接种种子培养液发酵4小时后，流加50％葡萄糖，0.5ml/min持续4小时后调为1ml/min持续4小时，再转换成0.5ml/min持续4小时。同时补液氨以控制pH＝7。发酵16小时后，葡萄糖改为0.2ml/min补料，5MNaOH控制pH＝7。

8.一种提纯多聚N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以大肠杆菌的发酵液为原料，采用0.1微米微滤膜过滤发酵液；

2)微滤后的上清液使用70000Dalton超滤膜超滤，弃去滤液，保留超滤后的浓缩液；

3)将超滤浓缩液加入等体积乙醇和1.5％v/v聚合氯化铝，离心除沉淀，保留上清，然后加入氯化钙使终浓度达到30mM后，加热到65，30min。离心除沉淀，收集上清；

4)加入二倍体积的95％乙醇，静置降温至8℃以下，维持1小时后，离心收集PSA沉淀；

5)溶解PSA沉淀，调节pH＝2。温度控制在20℃以下，使用反相色谱层析精制。

9.根据权利要求8所述的提纯多聚N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述步骤5)的反相色谱层析精制的步骤如下：采用30μm聚苯乙烯型反相色谱柱，流动相用0.005M硫酸配制pH＝2的水。将溶解于水的PSA上柱洗脱。连续记录流出液pH和210nm紫外吸收。收集紫外吸收峰且pH＜2的组分。流动相精确量取体积，加入等摩尔数的Ca(OH)2除去硫酸根。过滤或离心去除CaSO4沉淀，上清真空冷冻干燥得成品PSA。