[发明专利]微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸及其提纯方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸及其提纯方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸(PSA)已有很多研究和尝试。利用大肠杆菌天然菌种即可以完成。PSA本身有药品缓释剂，免疫佐剂，药物前体等多种用途。而且进一步水解可以得到单体N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，后者是重要的食品和药品原料。发酵法生产PSA目前已有文献报道如郭良栋等(产多聚唾液酸的菌种筛选及产酸条件，1998)等，但是经过中试实验多种指标并不能达到要求，其最高的发酵水平仅为1.2g/L左右，而且发酵来源为山梨醇，成本较昂贵，还必须去除内毒素。因此，限制了多聚N-乙酰神经氨酸(PSA)在治疗方面的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法及更为简洁与经济的多聚N-乙酰神经氨酸提纯方法，获得一种高纯度、不含内毒素的多聚N-乙酰神经氨酸，满足在食品、化妆品、药物生产的要求。

技术方案

本发明提供了一种高产多聚N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌，保藏号为CGMCC NO.5585。即本发明涉及的高产多聚N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC NO.5585，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院；保藏日期：2011年12月13日，分类命名及拉丁学名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

本发明还提供了一种使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在种子罐的基础培养基中接种大肠杆菌，发酵培养获得种子培养液；

2)将种子培养液接种于含上述基础培养基的发酵罐中，37℃温度下进行发酵培养，并流加碳源，控制溶氧为20％，控制pH＝7；

3)发酵后期，降低转速为75rpm/min，不控制溶氧，通气比例0.2，至发酵结束。

优选地，本发明所述的大肠杆菌的保藏号为CGMCC NO.5585。

优选地，本发明所述的基础培养基的碳源为葡萄糖。

优选地，本发明所述的基础培养基葡萄糖含量为10～35g/L。

优选地，本发明所述的使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法的步骤2)中流加的碳源为葡萄糖。

优选地，本发明所述的使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法的的步骤2)中流加葡萄糖的方法为：在接种种子培养液发酵4小时后，流加50％葡萄糖，0.5ml/min持续4小时后调为1ml/min持续4小时，再转换成0.5ml/min持续4小时。

同时补液氨以控制pH＝7。发酵16小时后，葡萄糖改为0.2ml/min补料，5MNaOH控制pH＝7。

本发明还提供了一种提纯多聚N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以大肠杆菌的发酵液为原料，采用0.1微米微滤膜过滤发酵液；

2)微滤后的上清液使用70000Dalton超滤膜超滤，弃去滤液，保留超滤后的浓缩液；

3)将超滤浓缩液加入等体积乙醇和1.5％v/v聚合氯化铝，离心除沉淀，保留上清，然后加入氯化钙使终浓度达到30mM后，加热到65，保持30min。离心除沉淀，收集上清；

4)加入二倍体积的95％乙醇，静置降温至8℃以下，维持1小时后，离心收集PSA沉淀；

5)溶解PSA沉淀，调节pH＝2。温度控制在20℃以下，使用反相色谱层析精制。

优选地，本发明所述的提纯多聚N-乙酰神经氨酸的方法中，所述步骤5)的反相色谱层析精制的步骤如下：采用30μm聚苯乙烯型反相色谱柱，流动相用0.005M硫酸配制pH＝2的水。将溶解于水的PSA上柱洗脱。上样量为装柱量的1/4体积。连续记录流出液pH和210nm紫外吸收。收集紫外吸收峰且pH＜2的组分。流动相精确量取体积，加入等摩尔数的Ca(OH)₂除去硫酸根。过滤或离心去除CaSO₄沉淀，上清真空冷冻干燥得成品PSA。

由上可以看出，本发明至少有以下技术效果：

1.本发明的多聚N-乙酰神经氨酸的发酵产率可以达到5～6g/L，高于现有技术的平均水平，特别适合于于工业化发酵生产PSA；

2.本发明的发酵原料使用便宜的葡萄糖代替较贵的山梨醇，可以进一步降低生产成本；