[发明专利]一种小鼠口腔癌及淋巴道转移模型的构建方法

权利要求书

1.一种小鼠口腔癌及淋巴道转移模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）动物选择及分组：取 6周龄雄性Balb/c小鼠为实验小鼠，并随机分成实验组和对照组；

（2）试剂配制：采用4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitroquinoline-oxide，4-NQO），用无菌蒸馏水配成0.1%浓度，置于4℃冰箱避光保存，用时以自来水配成的试剂A，置于避光瓶内让小鼠自由饮用；自来水为试剂B；

（3）动物喂养：实验组小鼠喂养试剂A，对照组小鼠仅给试剂B喂养，各喂养20周；20周后实验组小鼠停喂养试剂A，续用试剂B喂养至40周；对照组小鼠仍用试剂B 喂养；

（4）实验观察：实验组和对照组小鼠喂养9-40周内，实验组每2周随机处死4只，对照组每2周随机处死2只作为同期对照；并对两实验组进行一般观察、HE染色观察，免疫组织化学广谱细胞角蛋白染色观察；

（5）结论，通过步骤（4），得出4-NQO化学诱导法成功建立小鼠口腔癌前病变，口腔癌及淋巴道转移模型，并建立档案构成模型。

2.根据权利要求1所述的小鼠口腔癌及淋巴道转移模型的构建方法，其特征在于：

所述的实验小鼠为：6周龄雄性Balb/c小鼠，清洁级，体重为23.52±1.15 g，在室温18 ～ 25℃、湿度30% ～ 50% 、标准饲料喂养、24h光暗交替条件下饲养。

3.根据权利要求1所述的小鼠口腔癌及淋巴道转移模型的构建方法，其特征在于：

所述试剂A的4-硝基喹啉-1-氧化物含量为200mg/L。

4.根据权利要求1所述的小鼠口腔癌及淋巴道转移模型的构建方法，其特征在于：

所述的一般观察为：实验过程中每天观察小鼠精神状况、活动度、进食、饮水量、饮药量及毛色情况，每周记录小鼠体质量，饮水量，饮药量；每周掰开小鼠口腔观察口腔内变化，记录口腔内粘膜色泽，质地等是否改变，是否有斑块、溃疡或肿物出现。

5.根据权利要求1所述的小鼠口腔癌及淋巴道转移模型的构建方法，其特征在于：

所述的HE染色观察为：处死小鼠后立即取全舌、牙龈、口底、颊、腭、唇、颌下淋巴结、颌下腺、食管、胃、肝、脾、肺、肾、小肠、大肠等组织，用10%的中性甲醛溶液固定，常规组织处理，石蜡包埋，4μm切片，苏木精伊红染色，进行组织病理学观察；病理变化分单纯性上皮增生，异常增生（轻、中、重度）和癌（原位癌，浸润性癌和转移癌）。

6.根据权利要求1所述的小鼠口腔癌及淋巴道转移模型的构建方法，其特征在于：

所述免疫组织化学广谱细胞角蛋白淋巴结染色观察转移癌细胞为：采用免疫组织二步法，按照常规操作；小鼠颌下淋巴结石蜡标本连续4μm切片， pan-ck一抗（兔抗鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1:100稀释），二抗（羊抗鼠抗兔通用型，上海长岛公司），DAB显色，用pan-ck抗体已知阳性组织做阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照；结果判定：镜下观察，pan-ck兔抗鼠多克隆抗体在癌细胞内为阳性反应，呈棕黄色，定位在胞质内，淋巴结内固有成分不着色；11. 阳性染色细胞为转移细胞。