[发明专利]一种小鼠口腔癌及淋巴道转移模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种口腔癌及淋巴道转移动物模型构建方法，具体说，是涉及一种小鼠口腔癌及淋巴道转移模型的构建方法。

背景技术

口腔癌是发生于口腔粘膜的常见恶性肿瘤，特点是绝大多数为鳞状细胞癌，包括发生于舌，颊，口底，唇，牙龈等粘膜的癌瘤；浸润和转移出现较早，以淋巴道转移为主，一旦发生转移，生存率明显降低，目前临床尚无根治方法。因此口腔癌动物模型尤其是淋巴道转移模型的研究一直受到重视。目前，小鼠口腔癌模型的建立多采用移植瘤法，例如人类口腔癌细胞株裸鼠原位移植等，或者小鼠癌细胞原位移植等，但是该方法毕竟属于异种或者同种移植，操作过程虽简单但是不能模拟人类口腔癌发生发展的过程。亦有人采用诱癌剂局部涂擦法建立小鼠口腔癌模型，但是此方法操作极度繁琐且不自然。诱癌剂饮水法诱导动物口腔癌方法自然，且能模拟人类口腔癌发生发展的过程，但从目前情况看，诱导的癌瘤多为舌癌，偶有1、2例口腔其他粘膜癌，不能很好地体现人类口腔癌发生部位的多样性。尤其大多数未发现区域淋巴结转移或者仅仅个别转移。因此，现有的小鼠口腔癌淋巴道转移模型的构建多采用移植瘤的方法，转移率低，诱癌方法极不自然，不能模拟人类口腔癌发生发展直至转移的进化过程。从目前文献看，还未能获得满意的淋巴道转移模型。如果要探索癌瘤发生发展直至转移的时空连续性改变，模型难以胜任。

发明内容

本发明的目的是提供一种小鼠口腔癌及淋巴道转移模型的构建方法，建立小鼠与人类口腔癌发生发展转移极其类似的小鼠口腔癌及淋巴道转移模型，方法简单，成瘤率高，淋巴结转移率高，为人类口腔癌的防治提供有力的工具。

为达上述目的，本发明的技术方案为：

一种小鼠口腔癌及淋巴道转移模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）动物选择及分组：取 6周龄雄性Balb/c小鼠为实验小鼠，并随机分成实验组和对照组；

（2）试剂配制：采用4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitroquinoline-oxide，4-NQO），用无菌蒸馏水配成0.1%浓度，置于4℃冰箱避光保存，用时以自来水配成的试剂A，置于避光瓶内让小鼠自由饮用。自来水为试剂B；

（3）动物喂养：实验组小鼠喂养试剂A，对照组小鼠仅给试剂B喂养，各喂养20周；20周后实验组小鼠停喂养试剂A，续用试剂B喂养至40周，对照组小鼠仍用试剂B 喂养；

（4）实验观察：实验组和对照组小鼠喂养9-40周内，实验组每2周随机处死4只，对照组每2周随机处死2只作为同期对照；并对两实验组进行一般观察、苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining，简称HE染色 ) 染色观察，免疫组织化学广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin, pan-ck）淋巴结染色观察转移癌细胞；

（5）结论，通过步骤（4），得出4-NQO化学诱导法成功建立小鼠口腔癌前病变，口腔癌及淋巴道转移模型，并建立档案构成模型。

所述的实验小鼠为：6周龄雄性Balb/c小鼠，清洁级，体重为23.52±1.15 g，在室温18 ～ 25℃、湿度30% ～ 50% 、标准饲料喂养、24h光暗交替条件下饲养。

所述试剂A的4-硝基喹啉-1-氧化物含量为200mg/L。

所述的一般观察为：实验过程中每天观察小鼠精神状况、活动度、进食、饮水量、饮药量及毛色情况，每周记录小鼠体质量，饮水量，饮药量；每周掰开小鼠口腔观察口腔内变化，记录口腔内粘膜色泽，质地等是否改变，是否有斑块、溃疡或肿物出现。

所述的HE染色观察为：处死小鼠后立即取全舌、牙龈、口底、颊、腭、唇、颌下淋巴结、颌下腺、食管、胃、肝、脾、肺、肾、小肠、大肠等组织，用10%的中性甲醛溶液固定，常规组织处理，石蜡包埋，4μm切片，苏木精伊红染色，进行组织病理学观察；病理变化分单纯性上皮增生，异常增生（轻、中、重度）和癌（原位癌，浸润性癌和转移癌）。

所述免疫组织化学广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin, pan-ck）淋巴结染色观察转移癌细胞为：采用免疫组织二步法，按照常规操作。小鼠颌下淋巴结石蜡标本连续4μm切片， pan-ck一抗（兔抗鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1:100稀释），二抗（羊抗鼠抗兔通用型，上海长岛公司），DAB显色，用pan-ck抗体已知阳性组织做阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：镜下观察，pan-ck兔抗鼠多克隆抗体在癌细胞内为阳性反应，呈棕黄色，定位在胞质内，淋巴结内固有成分不着色。阳性染色细胞为转移细胞。