[发明专利]一株赖氨酸合成缺陷的炭疽杆菌株及其构建方法

权利要求书

1.一种制备重组菌A的方法，包括如下步骤：将抗性筛选标记物基因替换掉炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因，即得到重组菌A。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将抗性筛选标记物基因替换掉炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因通过同源重组实现。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述同源重组包括如下步骤：

1)将含有抗性筛选标记物基因的片段导入所述炭疽杆菌中，通过同源重组将所述抗性筛选标记物基因替换掉所述炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因，得到同源重组后重组菌B；所述含有抗性筛选标记物基因的片段具体通过重组载体导入炭疽杆菌中；

所述含有抗性筛选标记物基因的片段的核苷酸序列为序列表中的序列1；

2)将所述重组菌B在37℃-40℃培养，以去除所述重组载体，得到重组菌C。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述重组载体为将序列表中的序列1所示DNA片段插入温度敏感型穿梭质粒中得到的载体；所述温度敏感型穿梭质粒具体为pKSV7。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

在所述步骤1)前，还包括将所述重组载体去甲基化的步骤。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：

所述将所述重组载体去甲基化的方法包括如下步骤：

1)、将所述重组载体转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组菌D；

2)、从所述重组菌D中提取质粒，得到去甲基化的重组载体。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：

在所述步骤1)和步骤2)之间还包括将所述重组菌B经过传代培养的步骤。

在所述步骤2)后，还包括将所述重组菌C分别在仅含有所述抗性筛选标记物培养基和仅含有所述重组载体的抗性筛选标记物1的培养基中培养，选取在仅含有所述抗性筛选标记物培养基生长且在仅含有所述重组载体的抗性筛选标记物1的培养基上不生长的菌，得到重组菌A。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：

所述甲基化酶缺陷的大肠杆菌为大肠杆菌SCS110；

所述抗性筛选标记物为壮观霉素；

所述重组载体的抗性筛选标记物1为氯霉素。

9.由权利要求1-8中任一所述的方法制备的重组菌A。

10.一种DNA分子，为加下(1)或(2)或(3)：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。

或一种重组载体，为将所述的DNA分子插入温度敏感型穿梭质粒中得到的载体；所述温度敏感型穿梭质粒具体为pKSV7。