[发明专利]一株赖氨酸合成缺陷的炭疽杆菌株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株赖氨酸合成缺陷的炭疽杆菌株及其构建方法。

背景技术

炭疽杆菌是一种杆状、能形成芽胞的革兰氏阳性杆菌，能够引起人畜的炭疽病，如果不及时治疗，死亡率极高。炭疽是五大人畜共患病之一，危害性极强，对世界各地的人类健康及畜牧业都构成了严重威胁。炭疽杆菌的芽孢接触到皮肤伤口、消化道或呼吸道上皮后，将感染并会导致皮肤炭疽、肺炭疽、肠道炭疽等疾病。肺炭疽最为严重，将很快导致疾病和死亡。炭疽杆菌还被用作生物战剂和制造生物恐怖，对社会稳定构成威胁。故炭疽杆菌相关研究一直广受关注。

定量蛋白质组学是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门学科。这一概念的提出标志着蛋白质组技术的不断改进和完善。蛋白质组学研究已从对蛋白质简单的定性向精确的定量方向发展。蛋白质组定量的概念是试图准确地测定蛋白质组间相对含量的差别，而不在于测定其绝对的浓度。

2002年，丹麦Mann实验室建立了SILAC技术，并首次将其应用于定量蛋白质组研究，为全面、系统地定性和定量分析细胞复杂蛋白质组提供了有效的方案。SILAC基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代培养基中相应氨基酸，赖氨酸合成缺陷的菌株只能利用培养基中添加的赖氨酸，因而经5-6个生长周期后，稳定同位素标记的氨基酸将会完全掺入到新合成的蛋白质中替代原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按等比例混合，经分离纯化后即可进行定量质谱鉴定。SILAC具有无可比拟的巨大优势：它是一种体内标记技术，稳定同位素标记的氨基酸与天然氨基酸化学性质基本相同，对细胞无毒性，因而所标记的细胞和未标记细胞在生物学行为上几乎没有差异，所得实验结果也自然更加接近样品真实状态，并且其标记效率可高达100％。因此，可以说，SILAC技术是定量蛋白质组学研究的不二选择。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备重组菌A的方法。

本发明提供的方法，为将抗性筛选标记物基因替换掉炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因，即得到重组菌A。

上述方法中，所述将抗性筛选标记物基因替换掉炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因通过同源重组实现。

上述方法中，所述同源重组包括如下步骤：

1)将含有抗性筛选标记物基因的片段导入所述炭疽杆菌中，通过同源重组将所述抗性筛选标记物基因替换掉所述炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因，得到同源重组后重组菌B；所述含有抗性筛选标记物基因的片段具体通过重组载体导入炭疽杆菌中；

所述含有抗性筛选标记物基因的片段的核苷酸序列为序列表中的序列1；

2)将所述重组菌B在37℃-40℃培养，以去除所述重组载体，得到重组菌C。

上述方法中，步骤1)中，所述含有抗性筛选标记物基因的片段通过重组载体导入炭疽杆菌中；

所述重组载体为将序列表中的序列1所示DNA片段通过同源重组插入温度敏感型穿梭质粒中得到的载体；所述温度敏感型穿梭质粒具体为pKSV7；

上述方法中，在所述步骤1)前，还包括将所述重组载体去甲基化的步骤。

上述将所述重组载体去甲基化的方法包括如下步骤：

1)、将所述重组载体转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组菌D；

2)、从所述重组菌D中提取质粒，得到去甲基化的重组载体。

上述方法中，

在所述步骤1)和步骤2)之间还包括将所述重组菌B经过传代培养的步骤。

在所述步骤2)后，还包括将所述重组菌C分别在仅含有所述抗性筛选标记物培养基和仅含有所述重组载体的抗性筛选标记物1的培养基中培养，选取在仅含有所述抗性筛选标记物培养基生长且在仅含有所述重组载体的抗性筛选标记物1的培养基上不生长的菌，得到重组菌A。

上述方法中，所述甲基化酶缺陷的大肠杆菌为大肠杆菌SCS110；

所述抗性筛选标记物为壮观霉素，其核苷酸序列为序列1自5’末端第934-2215位核苷酸；

所述重组载体的抗性筛选标记物1为氯霉素。

上述炭疽杆菌为炭疽杆菌A16。

由上述的方法制备的重组菌A也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子，为如下(1)或(2)或(3)：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；