[发明专利]一种干扰BVDV复制的shRNA表达载体及构建的重组细胞

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种位点特异性整合的表达载体，特别涉及一种干扰BVDV复制的shRNA表达载体及构建的重组细胞。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是一种折叠的正链单股RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属。BVDV可以造成牛群的终生持续感染，是引起养牛业重大经济损失的一个重要因素。BVDV的伴发症在临床发展中由轻到重，涉及呼吸系统、肠道、生殖系统、免疫系统及内分泌系统。尽管已经有商品化的BVDV疫苗，但是BVDV的抗原多样性多导致疫苗接种失败。此外，尽管选择性测验后大范围扑杀屠宰阳性牛，由BVDV引起的疾病仍然在牛群中广泛流行。

RNA干扰(RNAi)是一种通过21-23核苷酸对特异性序列siRNA靶向作用于mRNA致使动物或植物的基因转录后沉默(Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，Yalcin A，Weber K，Tuschl T.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference incultured mammalian cells.Nature.2001 May 24；411(6836)：494-8.)。通过人工合成的siRNA、质粒、病毒介导shRNA可以触发哺乳动物细胞的特定基因沉默。已经有报道可以通过以上RNA干扰方法抑制HBV、HIV、HCV、FMDV等病毒的复制。近来，Lambeth等人研究发现通过siRNA和shRNA介导的RNA干扰有效地抑制了BVDV NADL株的复制(Lambeth LS，Moore RJ，Muralitharan MS，Doran TJ.Suppression of bovine viral diarrhea virus replication by smallinterfering RNA and short hairpin RNA-mediated RNAinterference.Vet Microbiol.2007 Jan 31；119(2-4)：132-43.Epub 2006 Sep 22.)。然而，BVDV具有抗原多样性，有两种基因型：BVDV-1型和BVDV-2型，包括至少13个BVDV-1基因型(BVDV-1a至BVDV-1l及一种未命名的)2个BVDV-2型(BVDV-2a和BVDV-2b)。对脊髓灰质炎病毒研究发现BVDV可能会形成抗siRNA的突变。避免出现逃避突变的替代策略是设计靶向BVDV基因组保留区的多重shRNA表达系统，或者使用siRNA组合。

随着分子生物学和分子遗传学及基因工程技术的发展与完善，为动物抗病转基因育种提供了新思路。体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(Jang G，Bhuiyan MM，Jeon HY，Ko KH，Park HJ，Kim MK，Kim JJ，Kang SK，Lee BC，Hwang WS.An approach for producing transgenic cloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alpha 1-antitrypsin gene.Theriogenology.2006 Jun；65(9)：1800-12.Epub 2005 Nov 21.)，该技术的优点是基因转移在体细胞培养阶段进行，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本(Wheeler MB，Walters EM.Transgenic technology and applications in swine.Theriogenology.2001 Nov 1；56(8)：1345-69.)。2006年，美国科学家Maga等培育出在乳腺中特异表达人溶菌酶的转基因山羊(Maga EA，Walker RL，Anderson GB，Murray JD.Consumption of milk from transgenic goats expressing humanlysozyme in the mammary gland results in the modulation ofintestinal microflora.Transgenic Res.2006 Aug；15(4)：515-9.)。

发明内容