[发明专利]一种铁皮石斛无激素组织培养的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种铁皮石斛无激素组织培养的方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale)为多年生草本，属附生兰类，俗名铁皮枫斗，因其老茎外呈黑色，又名为黑节草，石斛是常用的名贵中药，应用历史悠久，在《神农本草经》中被列为上品，现已证实它具有滋阴清热、生津益胃、止咳润肺、润喉明目、提高人体免疫功能、防治肿瘤和心血管疾病以及改善睡眠、防治白内障、延年益寿等功效。但由于生长环境特殊和分布局限，以及长期采挖，自然资源日趋枯竭，已被国家列为重点保护的野生药材并鼓励人工大面积栽培铁皮石斛，变野生为家种，以保障铁皮石斛资源的可持续性发展和利用。

铁皮石斛主要分布在亚热带地区，我国分布在西南和南方沿海各省，铁皮石斛种子极小，无胚乳，自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，很难用实生苗栽培，而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低，加上人为地过度采挖，已濒临灭绝，为了保持品种的优良性状，又能快速大量繁殖，通过铁皮石斛蒴果或者茎尖组织培养技术产生原球茎，在原球茎阶段进行增殖培养，再使原球茎分化苗繁育成小植株，1年内可以从原球茎繁育出百万株试管苗。铁皮石斛组织培养技术的研究，能有效地挽救这一濒临灭绝的珍稀物种，而且可以使重要的种质资源得以保存。

由于铁皮石斛具有巨大的药用价值，导致了长期无节制的采摘，致使资源濒临枯竭。1987年国家已将铁皮石斛列为重点保护野生珍稀药材品种，国家第一批《中国珍稀濒危保护植物名录》也将其列入其中。为了更好地保护铁皮石斛野生资源，变野生为家种，应大力发展规模化人工栽培，切实保障铁皮石斛资源的可持续利用。从20世纪70年代起，国内外有关机构便开始了铁皮石斛的研发工作，尤其在铁皮石斛的组织培养技术领域，但是一般组织培养过程中培养基的配制需要大量激素，比如“一种铁皮石斛快繁的组培方法”(申请号：2008101108704.5)、“一种铁皮石斛茎尖组培快速繁殖的育种方法”(申请号：200710066480.1)、“通过植物组织培养对铁皮石斛进行优良植物体的诱导和继代增殖培养的方法”(申请号：201110035697.2)等，不但消耗了大量的资源，破坏了植物的遗传多样性，扰乱了自然生长的规律性，增加了组培生产成本。

发明内容

本发明针对目前铁皮石斛组培过程中使用各种激素的问题提供一种更加环保、绿色、低成本、便捷的铁皮石斛无激素组织培养的方法，该方法减少在培养基配制过程中的资源浪费和时间消耗，为大规模的组培生产提供有利条件。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种铁皮石斛无激素组织培养的方法，该方法包括铁皮石斛种子萌发为圆球茎，圆球茎生长，增殖分化，茎段的生根、壮苗四个组织培养阶段，这四个阶段所用的培养基依次为：无激素的MS培养基、无激素的MS基本培养基+土豆泥15～20g/l培养基、无激素的MS基本培养基+香蕉泥15～20g/l+土豆泥15～20g/l培养基和无激素的1/2MS基本培养基+香蕉泥15～20g/l+土豆泥15～20g/l培养基。

所述四个阶段采用的培养条件：培养温度23～27℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d。

上述组织培养方法具体包括以下步骤：

a)将成熟铁皮石斛蒴果或铁皮石斛种子经过消毒处理，播入无激素的MS基本培养基中培养25～30天种胚膨大、萌发形成绿色的圆球茎；培养条件：培养温度23～27℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d；

b)将圆球茎转入无激素的MS培养基+土豆泥15～20g/l培养基中，培养25～30天，圆球茎重叠堆积在无激素培养基中，并有叶原基和分化苗出现；培养条件：培养温度23～27℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d；

c)将圆球茎分化苗转入无激素的MS基本培养基+香蕉泥15～20g/l+土豆泥15～20g/l培养基中，诱导20～30天后有叶原基和高度达到1～2cm小苗出现，继代培养30天成为中苗；培养条件：培养温度23～27℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d；

d)将中苗转入1/2MS基本培养基+香蕉泥15～20g/l+土豆泥15～20g/l的无激素培养基中，25～30天培育出5cm高以上的大苗并练苗移栽，练苗时保证75％～80％的含水量；培养条件：培养温度23～27℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d；