[发明专利]转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测试剂盒，试剂盒中包括荧光定量PCR试剂、PCR酶预混液，其特征是还含有以下成分：

内标准基因RBE4的上游引物、下游引物、探针，序列分别是SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3

外源基因克螟稻2号的上游引物、下游引物、探针，序列分别是SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：6；

标准品，为含有不同浓度的克螟稻2号和RBE4基因片段的质粒分子标准物质，数量为3～8个。

2.权利要求1所述的试剂盒，还含有质控品，为含量1％和5％的转基因水稻克螟稻2号种子粉末标准物质；且所述标准品的数量为4～6个。

3.权利要求2所述的试剂盒，所述标准品的数量为5个，克螟稻2号和RBE4基因片段的浓度分别为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²copy/ml。

4.一种转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测方法，其特征为：

1)精确称取质控品和待测样品，所述质控品如权利要求1所述；

2)分别提取质控品和待测样品的基因组DNA，所得DNA纯度应为A₂₆₀1.8～2.0，且浓度大于20ng/μL；

3)分别将内标准基因RBE4的上游引物、下游引物、探针、外源基因克螟稻2号的上游引物、下游引物、探针用去离子水溶解配制成浓度为10μM的工作液；

4)将每个标准品、质控品DNA和待测样品DNA分别进行荧光定量PCR扩增，所述标准品如权利要求1所述；

5)进行荧光定量PCR检测，根据标准品的不同所示浓度和测得的Ct值绘制内标准基因和外源基因的标准曲线，通过该标准曲线对待测样品进行定量。

5.权利要求4所述的检测方法，所述荧光定量PCR扩增中所用的PCR反应体系如下：

RBE4的反应体系：PCR酶预混液12.5μl，上游引物(400nM)0.5μl，下游引物(400nM)0.5μl，探针(200nM)0.25μl，克螟稻2号基因组DNA 5μl，去离子水补足25μl体系；

克螟稻2号的反应体系：PCR酶预混液12.5μl，上游引物(400nM)1μl，下游引物(400nM)1μl，探针(200nM)0.5μl，克螟稻2号基因组DNA 5ul，去离子水补足25μl体系。

6.权利要求4所述的检测方法，所述荧光定量PCR扩增中反应程序为：第一步94℃5分钟；第二步45个循环94℃15秒，60℃60秒。

7.权利要求4所述的检测方法，所述通过该标准曲线对待测样品进行定量，是根据外源基因和内标准基因的标准曲线的方程分别计算外源基因和内标准基因的拷贝数，然后计算外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数，再除以校正系数C得出定量检测结果；所述校正系数C是22.7％。

8.RBE4在转基因水稻克螟稻2号定量检测中作为内标准基因的应用。

9.一种在转基因生物定量检测中修正检测值与真实值偏差的方法，其步骤如下：

1)精确称取转基因生物与受体非转基因生物样品各一份；

2)分别提取转基因生物与受体非转基因生物基因组DNA，分别测定DNA浓度，

并分别测定所提取DNA的体积；

3)按照下列公式，分别计算转基因生物与受体非转基因生物的核酸提取效率E

4)按下列公式计算校正系数C：

C=E(transgene)E(receptor)]]>

式中，E(transgene)为转基因生物核酸提取效率，E(receptor)为受体非转基因生物核酸提取效率；

5)用转基因成分的检测值除以校正系数C，得到转基因成分的含量。

10.权利要求9所述的方法，步骤1～步骤4重复进行多次，每次得到一个校正系数C；然后求出所有校正系数C的算术平均值；重复次数为5～10次。