[发明专利]转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测方法和检测试剂盒。本发明还涉及一种用于修正转基因检测值与真实值间的偏差方法，具体地说，是建立一种计算修正偏差的校正系数的方法。

背景技术：

转基因水稻克螟稻2号是由受体水稻秀水11转入外源基因Cry1Ab后培育的抗虫水稻。

有关克螟稻2号的转基因检测方法有如下报道：岳运锋等发表在《中国油料作物学报》上的文章《转基因植物中标记基因定性PCR检测方法研究》，报道了有关克螟稻定性检测方法。但到目前为止针对转基因水稻克螟稻2号的精确定量检测方法的内容还尚未见到。

随着转基因技术的迅速发展，转基因植物及其产品的生物安全性以及可能对人类健康的影响引起了各国政府和民众的普遍关注。许多国家和地区都加强了对转基因商品的管理，出台了对转基因生物产品实施强制性标签的制度，规定了食品中转基因成分含量的最低标识限量。

目前，克螟稻2号已被农业部农业转基因生物安全委员会定义为最安全的等级，并通过了食用安全性认证。因为克螟稻2号有可能作为食品，因此，建立克螟稻2号水稻中转基因成分的定量检测方法，特别是研究出比较精确的定量检测方法和提供克螟稻2号水稻检测试剂非常必要。

转基因生物检测首先需要提取转基因植物的DNA。理想状态下，转基因植物与其受体植物的DNA提取效率应该相同。但有些生物在插入外源基因形成转基因生物后，会引起生物的某些特性发生变化，因此转基因生物的基因组在提取时会受到影响，提取的外源基因DNA浓度低于其真实浓度，导致转基因成分的检测值(即外源基因拷贝数/内标准基因的拷贝数分数)低于其实际值。

因此，需要研究一种在转基因生物检测中用于修正转基因检测值与真实值间的偏差方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种精确定量检测转基因水稻克螟稻2号(KMD2)及其制品的方法和检测试剂盒，且灵敏度高、特异性强、准确度好，精确度高。

本发明的另一目的是，建立一种用于修正转基因检测值与真实值间的偏差方法，具体地说，是建立一种计算修正偏差的校正系数的方法。

本发明首次建立了一种精确定量检测转基因水稻克螟稻2号及其制品的方法，为了满足转基因水稻克螟稻2号检测的精确定量，要求水稻内标准基因的扩增效果和扩增效率均与外源基因克螟稻2号相同。本发明人进行了如下工作：

①选择适合的内标准基因

分别合成了五种常用的水稻内标准基因水稻基因GOS9、PLD、SPS、RBE4、UBQ5引物后，以提取的转基因水稻克螟稻2号为基础，分别进行五个内标准基因和外源基因克螟稻的PCR扩增，将扩增后的PCR产物，进行电泳分析。结果发现RBE4基因的扩增产物亮度最接近外源基因克螟稻2号，其余四个内标准基因产物亮度都暗。

因此，确定了转基因水稻克螟稻2号检测的内标准基因为RBE4。

②得到适合两个基因扩增的最佳条件

合成内标准基因RBE4和外源基因克螟稻2号的引物和探针，进行PCR体系优化，得到适合两个基因扩增的最佳条件。

我们对现有技术中关于转基因该检测方法的五个元素的配比体系上进行了优化，得出了最佳的检测PCR体系。

③验证检测方法的效果

将提取的转基因水稻克螟稻2号基因组DNA进行系列稀释后作为模板，分别进行内标准基因RBE4和外源基因克螟稻2号的荧光定量PCR扩增，将每个稀释梯度浓度的模板所扩增的RBE4和克螟稻2号基因扩增的Ct值进行比较，结果发现：

克螟稻2号与RBE4的Ct值比值均在0.99到1之间，证明RBE4作为内标基因在实时荧光定量PCR检测中具有很好的效果。

RBE4的检测限和定量限分别为5个拷贝和15个拷贝，克螟稻2号的检测限和定量限分别为5个拷贝和15个拷贝，证明两个基因的检测灵敏度都很高。

④转基因克螟稻2号与非转基因受体水稻核酸提取效率比较

本发明还建立了一种方法，用于修正转基因检测值与真实值间的偏差。

本发明人发现，受体水稻秀水11在插入外源基因Cry1Ab所形成的转基因克螟稻2号的基因组在提取时会受到影响，测得的外源基因DNA浓度低于其真实浓度，导致转基因成分的检测值(即外源基因拷贝数/内标准基因的拷贝数分数)低于其实际值。

因此为了使检测结果接近于真实情况，需要建立一种校正方法。

欧盟IRMM的转基因植物标准物质研制中首先要将转基因植物与其受体植物的种子粉末的分别提取其核酸。