[发明专利]微生物中酶活性的诱导和稳定

说明书

本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/US2007/061315，中国国家申请号为200780011311.6，申请日为2007年1月30日，发明名称为“微生物中酶活性的诱导和稳定”。

技术领域

本发明主要涉及培育用于酶产生的微生物的方法和包含具有经诱导和/或稳定的活性的酶或微生物的组合物。更具体而言，本发明涉及通过使用特定的生长培养基来诱导微生物中所需酶活性的方法，以及涉及在酶或能产生所述酶的微生物内稳定所需活性的方法。

背景技术

长期以来，微生物及其酶在各种产品的制备中用作生物催化剂。酵母在糖至醇的发酵中的作用是立即可以想到的例子。近年来，对微生物及其酶在通常被认为是不符合酶用途的商业活动中的应用的兴趣日益增长。一个例子是微生物在工业加工，尤其是在废物处理中的应用。

含腈化合物广泛用于各种商业应用。例如，腈用在许多具有商业用途的化合物的合成中，所述化合物包括胺、酰胺、脒、羧酸、酯、醛、酮、亚胺和杂环化合物。腈也可用作溶剂、除草剂，以及用在去污剂和防腐剂的合成中。一种商业上更重要的腈是丙烯腈，其用在丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸纤维、共聚物树脂和腈橡胶的生产中。

在腈的生产中产生的废物流经常含有高浓度的危险性含氮化合物。例如，所述废物流可含有腈，诸如乙腈、丙烯腈、琥珀腈和富马腈。此外，这样的废物流还可含有危险性化合物，如氰化物、丙烯酰胺、丙烯醛和氰醇。由于危险性废物通常不能合法地排放到环境中，因此在商业生产过程中，处理废物流以除去或治理一种或多种危险性组分的方法是重要的。

已完成一种用于处理氮废物流的方法，其采用某些微生物将腈化合物转化为其相应的酰胺或酸。例如美国专利号3,940,316和美国专利号4,001,081公开了使用腈水合酶微生物由丙烯腈生产丙烯酰胺。

通常，腈转化微生物在涉及腈水合酶和酰胺酶的两步反应中降解脂肪族腈。在第一步中，腈水合酶催化所述腈(或氰醇)水解为相应的酰胺(或羟基酸)。在第二步中，酰胺酶催化所述酰胺水解为相应的酸或羟基酸。相似的是，一些微生物已显示出通过腈水解酶的作用直接将芳香族腈转化为其相应的酸从而降解这些腈。

由于起初的报道证明了丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物转化的潜在商业用途，因此，在所述腈的微生物降解中所涉及的酶已受到显著关注。手性酸的酶法制备(诸如由氰醇前体得到羟基酸)的可能性也已成为该领域内颇受关注的焦点。尽管有很有前景的结果，但是以上讨论的腈水合酶/酰胺酶转化的多种潜在应用依然未得到完全开发。

微生物及其酶的日益增加的用途的另一个例子是天冬氨酸的形成。天冬酰胺酶I是催化天冬酰胺水解为天冬氨酸的酶，如下所示：

HOOCCHNH₂CONH₂+H₂O→HOOCCHNH₂CH₂COOH+NH₃

天冬酰胺酶I可在细菌、植物和很多动物中找到；然而由于人白细胞不具有所必需的天冬酰胺合成酶，所以所述细胞不能生成天冬酰胺。因此已发现天冬酰胺酶I可有效治疗人恶性白血病。白血病细胞通常具有低水平的天冬酰胺合成酶，所述酶有时候完全缺失。因此，白血病细胞通常需要外界来源的天冬酰胺。由于天冬酰胺酶I将天冬酰胺转化为天冬氨酸，因此向患有白血病的患者施用天冬酰胺酶I进一步限制了所述癌细胞的天冬酰胺的可供来源，并且起到使得所述细胞变弱的作用，使其更容易受到化疗的影响。因此，通常作为联合疗法的一部分与化疗剂一起向白血病患者施用天冬酰胺酶I。

在这样的治疗中所使用的天冬酰胺酶I目前获自大肠杆菌(E.coli)(以异四聚体的形式)和欧文氏菌(Erwinia)(以同四聚体的形式)，但这些来源各自具有缺点。例如，获自大肠杆菌的天冬酰胺酶I不如获自欧文氏菌的天冬酰胺酶I有效。然而，与使用大肠杆菌相比，使用欧文氏菌产生天冬酰胺酶I更加困难。此外，这些来源可导致在所分离的酶中存在不利的革兰氏阴性毒素。因此，存在以下需求，即由各种微生物提高天冬酰胺酶I的产生，并避免同时产生有害的革兰氏阴性毒素。

稳定性，是实用性生物催化剂的关键因素，已成为在许多商业应用中使用腈水合酶和/或酰胺酶的重要障碍。虽然固定和化学稳定剂是公认的提高酶稳定性的方法，但目前的固定和稳定技术仍需要进一步的发展。因此，在本领域中仍存在对在各种微生物中，尤其是在能产生在含腈化合物的降解中有用的酶的微生物中，诱导高水平的酶活性的方法的需求。此外，还存在对提高含腈化合物降解中的关键酶的稳定性的方法的需求。