[发明专利]一种基于血清外来体检测急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种基于血清外来体检测急性冠脉综合症的液相芯片试剂盒，它主要包括，其特征在于： 所述的液相芯片试剂盒包括有以下组分：

1）包被微球：微球主要包括两类，一种直径为5.6μm的聚苯乙烯微球，另一种为直径为6.5μm的磁性微球，上述两类微球分别包被了CD11c捕获抗体的微球、包被了CD81捕获抗体的微球、包被了MHCⅡ捕获抗体的微球、包被了CD86捕获抗体的微球、包被了CD106捕获抗体的微球、包被了CD54 捕获抗体的微球和包被了CD3捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；

2）生物素标记检测抗体：含有分别用生物素标记的CD11c、CD81、MHCⅡ、CD86、CD106、CD54 和CD3检测抗体；

3）链亲合素藻红蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种基于血清外来体检测急性冠脉综合症的液相芯片试剂盒，其特征在于：每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为120-130个/μl；每种生物素标记检测抗体的使用浓度为1-4μg/ml。 

3.一种基于血清外来体检测急性冠脉综合症的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括如下步骤：

1）         按照试剂盒的组成，制备抗体包被微球，每种捕获抗体包被微球的制备方法相同：

将50ul微球活化后，经过高速离心沉淀，离心条件为≥7500g，5分钟；

吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280μl的50mM的MES溶液中，涡旋振荡25-30秒，超声25-30秒，后将微球离心，离心条件为≥8000g，离心1-2分钟；重复上述步骤；

吸弃上清，将微球重悬于100μl 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡旋振荡25-30秒，超声25-30秒；

往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2μg抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550μl；

用涡旋振荡器混匀，室温避光振荡2-2.5小时；

将偶联好抗体的微球离心沉淀，离心条件为≥8000g，离心1-2分钟；

吸弃上清，将微球重悬于500μl PBS-TBN溶液中，涡旋振荡25-30秒，超声振荡25-30秒；

室温避光振荡30分钟；再离心收集微球，离心条件为≥8000g，离心1-2分钟；

吸弃上清，将微球重悬于1ml 的PBS-TBN溶液中，涡旋振荡25-30秒，超声振荡25-30秒；离心收集微球，离心条件为≥8000g，离心1-2分钟；重复该步骤一次；

吸弃上清，将微球重悬于500-1000μl 的PBS-TBN溶液中；

每种包被好的微球通过Luminex仪器计数后置于2-8度避光单独保存，使用时，依据监测需要等比例混合，混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为125个/μl；

2）         按照试剂盒的组成，进行每种检测抗体的生物素标记：

依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，该体积作为目标体积；

用二甲亚砜溶液，配置10mg/ml的N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素反应液；

按摩尔比1:100于反应管中分别加入检测抗体与N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素反应液；

加入体积为目标体积1/10的pH8.9的碳酸氢钠溶液，随后加入pH7.4的PBS补至目标体积；

包上铝箔或放入避光暗盒中，将反应管或避光暗盒置于圆周振荡摇床上，于25度恒温箱中避光孵育4-5小时，转速为900rpm-1000rpm；

将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液透析过夜，以去除未反应的N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素反应液；

使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合；

3）         具有脂质双层膜结构的生物囊泡结构的抽提：

可以采用超速离心、超滤或者商品化的专用抽提试剂从固定量血清中抽提膜性小囊泡，并进行蛋白定量完成样品的标准化，制备成待测样品，所述的固定量血清体积大于等于1ml。