[发明专利]一种基于血清外来体检测急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外试剂盒的技术领域，具体地说是一种体外对急性冠脉综合征患者危险分层的试剂盒，特别是涉及基于血清外来体，即exosomes的液相芯片联合并行检测方法及试剂盒及其制备方法。

背景技术

动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）性血管疾病已成为威胁国人健康的头号杀手，随着我国经济的发展，发病率呈逐年上升趋势，我国每年用于该类疾病的医疗费用高达千亿元人民币，加强AS性血管疾病及其并发症的防治已成为我国重大疾病防治的主要任务。

AS性血管疾病引发的急性冠脉综合征（Acute coronary syndrome, ACS）是临床最常见和最严重的表现，而冠脉易损斑块破裂继发血栓形成是其发生的最主要病理基础。目前作为冠心病诊断“金标准”的冠状动脉造影并不能很好的识别易损斑块，易损斑块的识别和诊断主要依赖于血管内超声及血管镜等介入影像学手段，可以显示血管壁的病变，精确地区别病变的性质来识别易损斑块，但却不能检测斑块中的炎症活性，更由于其为有创性检查，技术条件要求高且费用较昂贵，限制了它的推广应用。因此，寻找能反映AS易损斑块敏感而特异性的血清学标志物，并通过有效干预，在易损斑块破裂前，早期将其识别并使之趋向稳定，有望达到减少ACS发生的目的。

Exosomes即外来体，是一类大小介于10-100nm之间具有脂质双层膜结构的生物囊泡结构，其主要是细胞在被刺激后大量分泌，通过多囊泡小体胞吐到细胞外，最早发现其主要来源于血小板，具有促凝的作用，后来大量研究证实：除外血小板，内皮细胞、血管平滑肌细胞、白细胞、淋巴细胞、红细胞等均能释放exosomes。近年来的研究证实不同疾病患者血清中的exosomes分泌异常增高，且其用于诊断和预测的特异性明显高于血清标志物，可以作为一种疾病危险分层的指标。

但现有的诊断试剂盒多集中于借助外周血清标志物提高对ACS的诊断敏感性和特异性方面，在改善患者的危险分层方面的相关试剂盒还是一个空白，同时相关试剂盒的特异性不高，而这方面恰恰是目前临床患者管理所急需的。

目前，对于exosomes标志物的测定主要依赖流式细胞分析，但流式细胞分析一次只能针对一个标志物进行检测，且操作繁琐、敏感度各异，不能真正满足临床的需要，此外由于上述exosomes标志物在ACS的病程中有不同的表达，上述问题使得各个指标在ACS患者的危险分层和预后判断中的价值各异，若能同时检测，则能大幅度提高ACS患者危险分层和预后判断的准确度。而固相生物芯片技术存在着重复性差、敏感度不高及操作繁琐的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的基于血清外来体检测急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒及其制备方法，它可克服现有技术中在改善患者的危险分层方面的相关试剂盒还是一个空白，同时相关试剂盒的特异性不高的一些不足。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种基于血清外来体检测急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒，它主要包括，其特征在于： 

所述的液相芯片试剂盒包括有以下组分：

1）包被微球：微球主要包括两类，一种直径为5.6μm的聚苯乙烯微球，另一种为直径为6.5μm的磁性微球，上述两类微球分别包被了CD11c捕获抗体的微球、包被了CD81捕获抗体的微球、包被了MHCⅡ捕获抗体的微球、包被了CD86捕获抗体的微球、包被了CD106捕获抗体的微球、包被了CD54 捕获抗体的微球和包被了CD3捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；

2）生物素标记检测抗体：含有分别用生物素标记的CD11c、CD81、MHCⅡ、CD86、CD106、CD54 和CD3检测抗体；

3）链亲合素藻红蛋白。

一种基于血清外来体检测急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括如下步骤： 

1）              按照试剂盒的组成，制备抗体包被微球，每种捕获抗体包被微球的制备方法相同：

将50ul微球活化后，经过高速离心沉淀，离心条件为≥7500g，5分钟；

吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280μl的50mM的MES溶液中，涡旋振荡25-30秒，超声25-30秒，后将微球离心，离心条件为≥8000g，离心1-2分钟；重复上述步骤；

吸弃上清，将微球重悬于100μl 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡旋振荡25-30秒，超声25-30秒；