[发明专利]辣椒CaCOI1.2基因及其重组表达载体和应用

权利要求书

1.辣椒CaCOI1.2基因，其特征在于，开放读码框序列由SEQ ID No.1中第186位至第1997位核苷酸组成。

2.权利要求1所述的辣椒CaCOI1.2基因，其特征在于，mRNA全长序列由SEQ ID No.1中第1位至第2041位核苷酸组成。

3.含有权利要求1或2所述辣椒CaCOI1.2基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，是将辣椒CaCOI1.2基因的开放读码框序列插入载体pBI121的多克隆位点中而获得的超表达双元载体pBI121-CaCOI1.2。

5.含有权利要求3或4所述重组表达载体的微生物转化体。

6.根据权利要求5所述的微生物转化体，其特征在于，所述微生物为农杆菌。

7.权利要求1或2所述的辣椒CaCOI1.2基因在大果实辣椒植株育种中的应用。

8.利用权利要求1所述的辣椒CaCOI1.2基因获得大果实辣椒植株的方法，其特征在于：包括如下步骤：

a．辣椒外植体的制备：将辣椒种子用体积分数为75%的乙醇溶液消毒，无菌水冲洗，再用饱和磷酸钠溶液浸泡，无菌水冲洗，最后用体积分数为1%的次氯酸钠灭菌，无菌水冲洗，蒸馏水浸泡，播种于1/2 MS培养基上，在温度为20±2℃、光周期为16 h/d和光照强度为1000-2000 lx的条件下培养；取培养12天的辣椒幼苗，剪掉子叶的两端部分，同时将下胚轴剪成长0.8-1.2 cm的小段，选取子叶和下胚轴小段接入预培养培养基上，在20±2℃、黑暗条件下预培养1天，作为外植体；所述1/2 MS培养基含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.6-0.8%的琼脂，pH为5.8；所述预培养培养基为MS培养基，含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、1 mg/L 的玉米素和0.2 mg/L的吲哚乙酸，pH为5.8；

b．辣椒CaCOI1.2基因农杆菌工程菌液的制备：将含有超表达双元载体pBI121-CaCOI1.2的根瘤农杆菌LBA4404菌株接种于YEB固体培养基上，在28±2℃、黑暗条件下培养2天，挑取单菌落，用YEB液体培养基培养2-3天，再按照体积比为0.01:1将所得菌液加入YEB液体培养基中过夜扩大培养至OD₆₀₀为1.8-2.0，室温下6000 rpm离心，弃上清，用YEB液体培养基重悬菌体，室温下6000 rpm离心，弃上清，用等体积的MS盐溶液重悬菌体，即得辣椒CaCOI1.2基因农杆菌工程菌液；所述超表达双元载体pBI121-CaCOI1.2是将辣椒CaCOI1.2基因的开放读码框序列插入载体pBI121的多克隆位点中而获得；所述YEB固体培养基含有质量分数为1.5%的琼脂、50 mg/L的卡那霉素、500 mg/L的链霉素和50 mg/L的利福平，pH为7.0；所述YEB液体培养基含有50 mg/L的卡那霉素、500 mg/L的链霉素和50 mg/L的利福平，pH为7.0；所述MS盐溶液的pH为5.8；

c．农杆菌的侵染转化：将步骤a制得的辣椒外植体浸入步骤b制得的辣椒CaCOI1.2基因农杆菌工程菌液中浸染10-23分钟，接入共培养培养基，在20±2℃、黑暗条件下培养2-3天，再转入抗性选择培养基，在25±2℃光照16小时、18±2℃黑暗8小时和1000-2000 lx光照强度的条件下培养至长出抗性不定芽，再将抗性不定芽转入延长选择培养基，在25±2℃光照16小时、18±2℃黑暗8小时和1000-2000 lx光照强度的条件下培养至形成新的植株，再将新的植株切断，所得茎段接入选择生根培养基，在25±2℃光照16小时、18±2℃黑暗8小时和1000-2000 lx光照强度的条件下培养至生根，获得转基因辣椒植株；所述共培养培养基为MS培养基，含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、1 mg/L的玉米素和0.2 mg/L的吲哚乙酸，pH为5.8；所述抗性选择培养基为MS培养基，含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、0.2 mg/L的吲哚乙酸、5 mg/L的硝酸银、5 mg/L的6-苄氨基嘌呤、500 mg/L的羧苄青霉素和50 mg/L的卡那霉素，pH为5.8；所述延长培养基为MS培养基，含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、0.5 mg/L的生长素、5 mg/L的硝酸银、5 mg/L 的6-苄氨基嘌呤、2 mg/L的赤霉素、500 mg/L的羧苄青霉素和50 mg/L的卡那霉素，pH为5.8；所述选择生根培养基为MS培养基，含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、0.1 mg/L的吲哚乙酸、0.2 mg/L的萘乙酸和50 mg/L的卡那霉素，pH为5.8；

d．大果实辣椒植株的获得：从步骤c获得的转基因辣椒植株中筛选出转基因阳性植株，即得大果实辣椒植株。